UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
20-25
Efecto antibacteriano del extracto etanólico del botoncillo (ACMELLA REPENS)
sobre  
Porphyromona gingivalis: Estudio in Vitro

Antibacterial effects of opposite-leaf spot flower (ACMELLA REPENS)
ethanol extract on porphyromona gingivalis: In Vitro Study



Andrea Lizbeth Chamorro Benalcázar, Marina Alejandra Cabrera Árias, Mariela Cumandá Balseca Ibarra


RESUMEN
Objetivo: Determinar el efecto antibacteriano del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) en diferentes concentraciones sobre la cepa de Porphyromona gingivalis. Materiales y metodos: En el presente estudio experimental, fueron utilizadas 24 cajas Petri con agar sangre, se inoculó P. gingivalis, y se colocaron discos con diferentes concentraciones del extracto etanólico de Botoncillo (25%, 50% y 100%), como sustancias control  Clorhexidina al 0,12% y suero fisiológico. A los 7 días de incubación se midieron con una regla milimetrada los halos de inhibición formados alrededor de los respectivos discos. Resultados: el extracto de Botoncillo al 100% mostró diferencias significativas en comparación con la concentración del 25% y 50% (0 < 0.05). Al comparar el extracto de Botoncillo al 100% con la Clorhexidina 0,12% se observó valores de inhibición más altos para Clorhexidina 0,12%. Conclusión: El extracto etanólico de Botoncillo presentó un efecto antibacteriano sobre P. gingivalis.

Palabras clave: Periodoncia; porphyromona gingivalis; técnicas in vitro.


ABSTRACT
Objective: To determine the antibacterial effect of ethanolic extract Buttonwood (Acmella repens) in Different Concentrations on Porphyromonas gingivalis strain. Materials and methods: In this experimental study, were used 24 Petri dishes with blood agar was inoculated with P. gingivalis, and discs with different concentrations of ethanol extract of Buttonwood (25 %, 50 % and 100 % ) were placed, control substance as chlorhexidine and 0.12% saline. After 7 days of incubation actual measured with a millimeter ruler inhibition halos formed around the respective discs. Results: Buttonwood extract 100% showed significant differences compared to the concentration of 25% and 50 % (0 < 0.05). When comparing Buttonwood extract 100% with chlorhexidine 0.12 % higher values for chlorhexidine 0.12 % inhibition was observed. Conclusion: The ethanol extract of Buttonwood presented an antibacterial effect on P. gingivalis.

Keywords: Periodontics; porphyromonas gingivalis; techniques in vitro.




  1. Odontóloga, Facultad de Odontología, Universidad Central del Ecuador, Quito; Apartado postal: Ecuador, Pichincha, Quito, Quitumbe, Av. Quitumbe Ñan y Av. Amaru Ñan, andrecoockie@hotmail.com.
  2. Maestra en Ciencias Odontologícas (Universidad Nacional Autónoma de México), Especialista en Odontopediatria (Universidad Central del Ecuador), Docente Investigador, Instituto de Investigación y Posgrado, Facultad de Odontología, Universidad Central del Ecuador, Quito;  alecabrera_arias@hotmail.com.
  3. PhD. en Formación, Especialista en Periodoncia, Docente Investigador, Instituto de Investigación y Posgrado, Facultad de Odontología, Universidad Central del Ecuador, Quito; marielabalsecai@yahoo.com.

INTRODUCCIÓN

Tanto la medicina natural como la fitoterapia han cobrado mucho interés por parte de investigadores de distintas áreas, y de manera especial en Odontología.(1) El 80% de la población ecuatoriana depende de la medicina tradicional y por consiguiente de las plantas o productos naturales basados en éstas para su salud y bienestar.(2) En el Ecuador existe un sinnúmero de plantas que nuestros pueblos indígenas utilizan con fines medicinales. Durante siglos estas plantas se han utilizado en forma empírica y actualmente han llamado la atención de los investigadores a fin de descubrir los principios activos que justifiquen sus usos terapeúticos. Muchas especies vegetales encontradas en el Ecuador, contienen una gran cantidad de metabolitos secundarios con propiedades antibacterianas, es el caso del Botoncillo.(3)

Estudios fitoquímicos de especies como el Botoncillo Acmella repens (Walter) Rich,(4,5) han permitido identificar la presencia de ciertas sustancias como aminoácidos, alcaloides, y flavonoides además de principios activos.(6) Atribuyendo a la planta propiedades alimenticias y medicinales con potencial farmacológico como antiinflamatorio, anestésico, analgésico, antimicótico, antiséptico y antibacteriano.(7,8) Así como también el uso etnomedicinal para el tratamiento y prevención de la gingivitis y periodontitis, motivan a una investigación más especializada.(9)

La periodontitis  crónica es una  patología infecciosa – inflamatoria de etiología multifactorial con alta frecuencia en la población adulta, cuyo factor etiológico primario es el microbiológico, siendo la Porphyromona gingivalis uno de los microrganismos anaerobios negativos más importantes, debido a los numerosos factores de virulencia que la bacteria posee.(10,11)

El tratamiento y/o prevención de la periodontitis incluyen los métodos tradicionales como son la remoción mecánica de la placa supra y sub gingival, el uso de agentes antimicrobianos y la eliminación de los factores de riesgo.(12) Frente a la aparición de cepas resistentes a los antibióticos y de efectos secundarios no deseados se busca nuevas alternativas de origen natural que eliminen o disminuyan la carga bacteriana.(1)
No se han realizado estudios sobre la actividad antibacteriana del botoncillo sobre bacterias periodonto patógenas por lo que el presente estudio tiene como objetivo determinar la acción inhibitoria del extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) sobre Porphyromona gingivalis.


MATERIALES Y MÉTODOS

Aspectos éticos y diseño de estudio. El presente estudio experimental fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador (UCE). Se comparó el efecto inhibitorio antimicrobiano del extracto de Botoncillo, a concentraciones de 25%, 50% y 100% comparado con clorhexidina al 0,12% y suero fisiológico sobre Porphyromonas gingivalis.
Recolección y preparación del extracto: Las plantas de Botoncillo fueron recolectadas en estado fresco en el mes de octubre del 2015 en la parroquia García Moreno, Cantón Bolívar, Provincia del Carchi, asegurándose que las mismas estén completamente sanas, posteriormente fueron enviadas al departamento de Ofertas Servicios y Productos (OSP)  de la Facultad de Química  de la (UCE), para la preparación del extracto etanólico. Mediante el método de percolación fueron elaborados extractos de las flores del Botoncillo, a concentraciones de 25%, 50% y 100% y almacenadas en frascos ámbar bajo refrigeración a - 8° por 7 días.
Experimentación del efecto inhibitorio: Se utilizó una cepa bacteriana ATCC® 33277™ (American Type Culture Collection) de Porphyromona gingivalis, identificada y certificada por laboratorios microbiológicos de los Estados Unidos de America e importada por Medibac S.A, se procedió a viabilizar la cepa bacteriana sembrando los cristales liofilizados contenidos en el empaque Kwik-Stik, en caldo de tripticasa soya, el tubo fue llevado a la jarra de anaerobiosis, para ser incubado a 35° por 7 días, comprobando mediante la turbidez la activación de la cepa. Previo a la inoculación en las placas de agar sangre se realizó el estándar de turbidez de Mc Farland 0,5 (1X106 UFC/ml) colocando el inóculo de la cepa en un tubo de ensayo con 2ml de agua bidestilada. Se aplicó las soluciones de la siguiente manera



:
Tabla 1. Experimentación del efecto inhibitorio.

Mediante un hisopo estéril se procedió a sembrar  de manera uniforme en 24 placas de agar sangre mediante la técnica de diseminación, posteriormente se colocaron los discos en las placas inoculadas a una distancia no menor de 15mm entre sí y a 1,5 cm del borde de la placa. Las placas fueron colocadas en una jarra hermética con un generador de anaerobiosis (Anaerogen 1.5 lts) por 7 días a 35° en la incubadora. Para la obtención de los datos de los halos de inhibición se tomó en cuenta la escala de Duraffourd et al., 1986 (13) donde los valores menores a 8mm son considerados sensibilidad nula, 9 a 14mm sensibilidad límite y valores mayores a 20mm sensibilidad sensible.

Analisis Estadístico: Todos los datos obtenidos mediante la ayuda de una regla milimetrada fueron registrados y organizados en Microsoft Excel y posteriormente se trasladó a paquetes estadísticos SPSS 2.0.

Los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante las pruebas de Kruskal – Wallis, U de Mann- Whitney y Test de Dunn para un nivel de significancia de 5%. Los residuos patológicos que se generaron se los clasifico como Tipo A.2 ya que son microrganismos y medios de cultivo provenientes de un laboratorio de investigación. Estos residuos y el material utilizado fueron desinfectados mediante el uso de agentes químicos (glutaraldehído, hipoclorito de sodio) y autoclave, previo a su eliminación como residuos patógenos en una bolsa roja debidamente rotulada.



Figura 1. Halos de inhibición a los 7 días de incubación

Fueron inoculadas 24 placas Petri con 20ul de solución de cada una de las sustancias,  se evalúo el efecto inhibitorio de las diferentes concentraciones del extracto etanólico de Botoncillo sobre la cepa de Porphyromona gingivalis, observándose un efecto inhibitorio (mediana 10,6 mm)  para el extracto al 100% y con el grupo control positivo (clorhexidina) de 26,5 mm. Las otras dos concentraciones y el grupo control negativo no tuvieron efectividad inhibitoria (ver tabla 2).



Tabla 2. Comparación entre los diferentes extractos de Botoncillo (25%, 50% y 100%), Grupo Control + (Clorhexidina 0,12%) y Grupo Control negativo (suero fisiológico).TEST KRUSKAL WALLIS.

Sin embargo, al observar la efectividad del extracto de Botoncillo al 100% y el Grupo Control positivo se comparó entre las dos sustancias para observar cual tuvo mejor efectividad, observándose una diferencia significativa p=0.00 entre estas dos sustancias, siendo la Clorhexidina mejor que el extracto etanólico del Botoncillo al 100% (Ver Tabla 2).



Tabla 3. Comparación entre el control positivo Clorhexidina al 0,12% y el extracto etanólico de Botoncillo al 100%. TEST U DE MANN WHITNEY.

De acuerdo a los resultados obtenidos con el Test de Dunn, existen diferencias significativas entre el grupo del extracto de Botoncillo 100% y Clorhexidina al 0,12% siendo p<0.05.

DISCUSIÓN

Este estudio in vitro permitió determinar que el extracto etanólico deBotoncillo al 100%, posee actividad antibacteriana sobre Porphyromona gingivalis mediante el Test de difusión en Agar con discos.

Estudios in vitro realizados por otros investigadores indican que el Botoncillo tiene acción antibacteriana a nivel de patógenos comunes, como Escherichia coli, Klebsiella pnumoniae, Proteus vulgaris ,(8) siendo estos microorganismos Gram negativos y anaerobios facultativos, concordando con los resultados obtenidos para la Porphyromona gingivalis que es una bacteria Gram negativa, anaerobia estricta.

Un estudio in vitro realizado en la India utilizando como medicación intraconducto en concentraciones de 2%, 5% y 10% de Botoncillo con éter de petróleo como solvente, mostró actividad antibacteriana frente a Enterococcus faecalis comparada con Hidróxido de Calcio (CaOH)2..(9)

Los resultados obtenidos de este estudio, no se pueden comparar con resultados de otras investigaciones a nivel de bacterias perio donto patógenas orales,  pues no existen trabajos con Porphyromona gingivalis en los que se haya empleado el extracto de Botoncillo, siendo el primer estudio que se ha realizado, se tuvieron limitaciones de tipo bibliográfico.


CONCLUSIÓN

El extracto etanólico de Botoncillo (Acmella repens) al 100%, tiene la propiedad de inhibir el crecimiento bacteriano in vitro de la bacteria Porphyromona gingivalis.


BIBLIOGRAFÍA

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  2. Ximena BC. Ecuador: Uso y comercio de platans medicinales, siutuacion actual y adpectos importantes para su conservacion Reino Unido: Traffic International; 1999. Disponible en: https://portals.iucn.org/library/sites/library/files/documents/Traf-061.pdf
  3. Naranjo, Plutarco, Coba JS. Etnomedicina en el Ecuador. Memorias de las Segundas Jornadas Ecuatorianas de Etnomedicina Quito: Universidad Andina Simón Bolívar / Corporación Editora Nacional ; 2003. Disponible en: http://www.uasb.edu.ec/publicacion?-etnomedicina-en-el-ecuador-memorias-de-las-segundas-jornadas-ecuatorianas-de-etnomedicina-235
  4. Comision Nacional para el conocimiento y uso de la biodiversidad. Conabio. [Online]. [cited 2016 Enero. Disponible en: http://www.conabio.gob.mx/malezasdemexico/asteraceae/acmella-repens/fichas/pagina1.htm
  5. Cerón CE. Manual de Botánica Sistemática Etnbotánica y Métodos de Estudio en el Ecuador. Herbario “Alfredo Paredes” QAP. Quito: Escuela de Biología; Universidad Central del Ecuador; 2003.
  6. Dubey S, Maity S, Singh M, Saraf S, and Sudipta Saha S. Phytochemistry, Pharmacology and Toxicology of Spilanthes acmella: A Review. Advances in Pharmacological Sciences 2013; Article ID, 4237501-9. Disponible en: http://www.hindawi.com/journals/aps/2013/423750/
  7. Sathyaprasad S, Jose BK, Chandra HS. Antimicrobial and antifungal efficacy of Spilanthes acmella as an intracanal medicament in comparison to calcium hydroxide: An in vitro study. Indian J Dent Res. 2015 sep; 26: p. 528-32. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26672426
  8. Valdivia MI,  Párraga QA. Estudio etnobotánico y fitoquímico de la Acmella spilanthoides Cass (Botoncillo) y su importancia en la medicina. Revista Praxis. 2011 ene; 7(1): 60-71. Disponible en: http://es.calameo.com/read/0016477031fa510e2b6bf
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  10. Koneman E, Washington C, Allen S, Procop G, Janda W, Schereckenberger P, Woods G, Diagnóstico Microbiológico. Texto y atlas en color. 6a. ed. Buenos aires: Médica Panamericana; 2008.
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  12. Socransky SS,  Haffajee AD. Biofilms dentales: objetivos terapeúticos difíciles. Periodontology 2000. 2003; 3(1): p.12-55. Disponible en: https://es.scribd.com/doc/36325905/Biofilms-dentales-Objetivos-terapeuticos-dificiles
  13. Duraffourd C, D’hervocourt L, Lapraz JC. Cuadernos de Fitoterapia Clínica. 1° edición. Barcelona, España: Edit. Masson S.A. 1986.


CITA SUGERIDA: Chamorro AL, Cabrera MA, Balseca MC. Efecto antibacteriano del extracto etanólico del botoncillo (ACMELLA REPENS) sobre  Porphyromona gingivalis: Estudio in Vitro. Revista Facultad de “ODONTOLOGÍA”. 2016 jul; 18(1): p. 20-25. Disponible en: http://revistadigital.uce.edu.ec/index.php/ODONTOLOGIA/article/view/117 



      RECIBIDO     22  Febrero del 2016
  ACEPTADO     6  Mayo del 2016

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