Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios

REVISTA QUÍMICA CENTRAL

Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro

para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios

Use of Agrobacterium tumefaciens as a generator of tumors in vitro for the analysis of antitu-

mor activity of secondary metabolites

Andrea Parreño

Universidad Central del Ecuador, Ecuador

DOI: https://doi.org/10.29166/quimica.v7i2.3301 ISSN impresa 1390-5562

Creative commons NoComercial 4.0 Internacional fcq.quimica.central@uce.edu.ec

facultad de ciencias químicas química central

universidad central del ecuador 2021, vol 7(2), julio-diciembre, pp. 40-43

abstract

is review article discusses the potato disc assay developed between 1955 and 1982 using Agrobacte-

rium tumefaciens strains to generate tumors, we will see why it can be used to test antitumor activity of

various secondary metabolites and the advantages of this screening compared with other tests based on

cell lines in addition to the importance of its use in various current publications, especially in developing

countries where ancestral medicine is still widely used.

resumen

El presente artículo de revisión habla sobre el ensayo de disco de papa desarrollado entre los años 1955 y

1982 usando cepas de Agrobacterium tumefaciens para generar tumores, veremos por qué puede ser usa-

do para probar actividad antitumoral de diversos metabolitos secundarios estudiados y de las ventajas

que tiene este screening en comparación con otros ensayos a base de líneas celulares, además de la impor-

tancia de su uso en diversas publicaciones actuales, especialmente en países en vías de desarrollo donde

la medicina ancestral aún es ampliamente usada.

introducción

La agalla de corona es una enfermedad de carácter vege-

tal que infecta a la mayoría de las plantas dicotiledóneas,

su principal característica es producir agallas a nivel de

las raíces y cuello de las mismas. El microorganismo

causante de esta enfermedad es Agrobacterium tumefa-

ciens actualmente llamada Rhizobium radiobacter, que es

una bacteria móvil en forma de varilla, gram negativo,

perteneciente a la familia Rhizobiaceae. Esta bacteria in-

gresa a los tejidos vegetales a través de heridas frescas

en una amplia gama de plantas que, como se mencionó

anteriormente, incluyen muchas dicotiledóneas, aunque

historial del artículo

Recepción: 20/09/2021

Aceptación: 20/11/2021

pal abras clave

Ensayo de disco de papa, tumores,

inhibición, actividad antitumoral.

article history

Received: 20/09/2021

Accepted: 20/11/2021

key words

Potato discs assay, tumors, inhibition,

antitumoral activity.

Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios

también se observa la infección en pocas monocotiledó-

neas y algunas gimnospermas (Hajivand, 2013, citado

por Rahman et al., 2020).

Las cepas patógenas comparten la característica de

contener un plásmido llamado Ti por sus siglas en inglés

(tumor-inducing) de entre 200 y 800 pkb, el mecanis-

mo por el que infecta a la planta se debe a la transferen-

cia de adn del plásmido Ti a las células vegetales, los

genes insertados inuyen indirectamente en la biosín-

tesis de auxinas y citoquininas que causa una división

celular descontrolada y tumorigenicidad. La capacidad

de esta bacteria de transferir su adn es ampliamente

usado en varios bioensayos (Hajivand, 2013, citado por

Rahman et al., 2020), especialmente para la transforma-

ción y mejoramiento de plantas (plantas transgénicas),

trasformación de hongos y también para varios estudios

moleculares; además de estos ensayos A. tumefaciens

sigue siendo usada para evaluar actividad antitumo-

ral y antimitótica de diversos metabolitos; esta revisión

se enfocará en la importancia del uso de A. tumefaciens

como generador de tumores en discos de papa y revi-

saremos algunas investigaciones actuales donde sigue

siendo usada como screening inicial para compuestos

que recientemente son estudiados y que podrían tener

capacidades antitumorales.

ensayo de disco de papa como screening

inicial para el análisis de compuestos

con actividad antitumoral

El primer ensayo semicuantitativo para inducción de tu-

mores mediante A. tumefaciens fue desarrollado en 1955

por Klein y Tenenbau, quienes utilizaron tejido de raíz

de zanahoria, desafortunadamente debido a la limitada

utilidad que tenía para la evaluación bioquímica asocia-

da con la conversión de células normales a células tumo-

rales este tejido fue descartado y reemplazado por el en-

sayo realizado por Anand y Heberlein quienes probaron

los discos de papa; la simplicidad del procedimiento y la

homogeneidad del tejido, junto con el hecho de que el

bioensayo es cuantitativo, hizo que este sistema sea ideal

para la investigación bioquímica de compuestos con po-

sible capacidad antitumoral (1977).

Para el año de 1981 Galsky et al. compararon este en-

sayo con ensayos en líneas celulares. Tomaron la infor-

mación de varios compuestos con actividad antitumoral

probados en ensayos de leucemia de ratón (P388) y com-

pararon los mismos en el ensayo de disco de papa; obser-

varon que existía una posible correlación y establecieron

varias ventajas sobre otros modelos celulares. También se

demostró que la acción antitumoral de estos compuestos

no era por antibiosis (incapacidad de organismos de vivir

en inmediaciones de otros) ni por inhibición de la unión

bacteriana a los sitios de unión al tumor.

En estudios preliminares entre 1980 y 1983, efectuados

en la Universidad de Purdue, se modicó el ensayo de

disco de papa de Galsky para hacerlo un ensayo de rutina

y ser usado como preselección antitumoral en extractos

crudos de plantas. Dentro de las modicaciones hechas

existen dos que son las más notables: 1. Usar dmso (di-

metil sulfoxido) como solvente universal para los extrac-

tos de plantas; y 2. usar una solución de yodo / yoduro

de potasio para teñir las células de fondo que contie-

nen almidón, es decir, las células no tumorales (norma-

les) para facilitar el conteo de tumores (Ferrigni et al.,

1982), además de las modicaciones hechas probaron su

efectividad con una evaluación estadística apropiada y

se observó que los resultados del cribado de plantas del

ensayo de disco de papa estaban fuertemente asociados

con los resultados de 3PS (P388), con lo que denitiva-

mente se concluyó que este ensayo podría emplearse ru-

tinariamente y que podía ser usado como una preselec-

ción comparativamente rápida, económica, segura, que

ahorra animales y es estadísticamente conable para la

actividad antitumoral in vivo (Ferrigni et al., 1982, cita-

do por McLaughlin & Rogers, 1998).

ensayo de disco de papa

El ensayo de Ferrigni et al., con las modicaciones he-

chas por Galsky es el ensayo de elección, algunos inves-

tigadores lo modican dependiendo de las necesitades

del estudio, pero generalmente el protocolo inicia con un

cultivo 48 horas de A. tumefacies en medio de extracto de

levadura (yem), que es ajustado a 1 x 10

ufc con dimetil

sulfoxido (dmso).

Por otro lado, se lavan y desinfectan papas Russet (So-

lanum tuberosum L.), utilizando hipoclorito de sodio, se

cortan para que la supercie quede sin cáscara; éstas se

colocan nuevamente en hipoclorito de sodio para su des-

infección y se procede a cortar en el centro de la papa

con ayuda de un taladro de corchos de aproximadamen-

te 10 mm de diámetro; al cilindro obtenido se le cortan y

descartan los extremos y el restante es fraccionado en ci-

lindros más pequeños de 5 mm de espesor, todo esto se

realiza bajo condiciones asépticas y en cámara de ujo.

Los cilindros obtenidos se colocan en una placa con

agar al 1,5% y se inoculan con 50 µl la mezcla de extracto

(solución)/agua/bacteria apropiada y se incuban a tem-

peratura ambiente durante 12 días.

Al nalizar el tiempo de incubación, los discos se ti-

ñen con reactivo de Lugol y son observados en un micros-

copio de disección, donde se puede evidenciar el tejido de

papa de color azul oscuro a marrón y los tumores de co-

lor crema a naranja.

Para calcular el porcentaje de inhibición se conside-

ra la siguiente fórmula:

Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios

El ensayo previamente descrito eventualmente se

utiliza como parte de un screening inicial para eval-

uar actividad biológica en plantas debido a su bajo

costo y al fácil uso por lo que esto resulta ser una

ventaja para preseleccionar extractos y ampliar el

estudio de su actividad antitumoral en caso de ob-

tener una inhibición importante de tumores.

su uso como screening inicial de com-

puestos con capacidades antitumorales

en investigaciones actuales.

En la búsqueda de nuevos medicamentos para tratar dife-

rentes enfermedades los investigadores observan la medi-

cina tradicional o medicina ancestral y las diferentes plan-

tas usadas en ésta. Para empezar a analizar la actividad

antitumoral de dichas plantas y los extractos obtenidos de

éstas, el ensayo de disco de papa resulta ser una de las pri-

meras opciones debido a su bajo costo y facilidad de im-

plementación. Actualmente existen varias publicaciones

donde se reere la utilización de este ensayo, por lo que en

este apartado se resumirán las más relevantes.

Myanmar es un país en vías de desarrollo conocido

como el jardín botánico del mundo por su alta produc-

ción de plantas medicinales. Aquí, según la Organización

Mundial de la Salud (oms), aproximadamente el 80% de la

población depende exclusivamente de esta medicina, por

lo que Lae et al. en su estudio quisieron determinar las ca-

racterísticas toquímicas y algunas actividades biológi-

cas de los extractos obtenidos de Phyllanthus Albizzioides,

una planta medicinal muy usada. En esta investigación

se encontró que el extracto etanólico de la corteza del ta-

llo mostraba una signicativa inhibición de tumores pro-

vocados por A. tumefaciens en disco de papa, además se

encontró fuerte actividad antioxidante, antimicrobiana y

antidiabética de estos extractos; el autor concluye que su

estudio puede contribuir con el uso extendido de los tallos

de la planta en la medicina tradicional de su país (2019).

Otra revisión actual donde se muestra el uso de este

ensayo es el realizado por akur et al., la investigación

proporciona información sobre valores nutricionales, to-

química y aspectos farmacológicos modernos de un fru-

to muy utilizado en la India llamado manzana de madera

(Feronia limonia), que ha sido subutilizada y descuidada.

La investigación utilizó el disco de papa para evaluar acti-

vidad antitumoral y aunque se encontró que esta era poco

signicativa, se llegó a la conclusión que este fruto tiene

diversas capacidades medicinales que se necesitan conti-

nuar investigando (2020).

En el artículo publicado por Tun et al., se evaluó la

actividad antitumoral de los extractos obtenidos de los

tallos de Allamanda cathartica L, se encontró que los ex-

tractos de etanol, acetato de etilo y éter de petróleo tenían

una signicativa inhibición de los tumores, dependiente

de la concentración de los mismos. Por otro lado, se en-

contró actividad antioxidante y antimicrobiana especial-

mente en los extractos con etanol, por lo que los autores

concluyen que el estudio podría contribuir a que los ta-

llos de A. cathartica se puedan utilizar en la formulación

de la medicina tradicional, además de que se puede con-

tinuar investigando su capacidad antitumoral con otros

ensayos en líneas celulares más complejas (2020).

perspectiva/punto de vista

El Ecuador es un país megadiverso con gran variedad de

vegetación, dentro de las plantas que han sido reportadas

la cuarta parte son endémicas y de estas el 7% fueron

catalogadas como útiles (De la Torre et al., 2008)

El 60% de estas plantas halladas en Ecuador tienen

usos medicinales, pero aún falta seguir investigando y

profundizando el estudio de los metabolitos contenidos

y sus propiedades bioquímicas y biológicas; como ha que-

dado evidenciado en los estudios reportados en este ar-

tículo de revisión el ensayo de disco de papa es viable y

económico como screening inicial para determinar pro-

piedades antitumorales, sin embargo, en el Ecuador no se

ha reportado su uso estandarizado destacando así la im-

portancia de desarrollar esta metodología y además ais-

lar y mantener la cepa de A. tumefenciens generadora de

tumores para que pueda ser usada como un ensayo de ru-

tina en nuevas investigaciones.

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