Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis de población en riesgo
i-issn 1390-5562 | e-issn 2477-9121 | año 2021 | volumen 7 | número 2 | pp. 20-31
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REVISTA QUÍMICA CENTRAL
Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacari-
dosis de población en riesgo
Biochemical tests for screening and timely diagnosis of Mucopolysaccharidosis for population
at risk
Walkyrie Aguilar (†)
a
| Guadalupe Jibaja
b
| Lourdes Pazmiño
c
a
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
b
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
c
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
DOI: https://doi.org/10.29166/quimica.v7i2.3304 ISSN impresa 1390-5562
© 2021 Universidad Central del Ecuador ISSN electrónica 2477- 9121
Creative commons NoComercial 4.0 Internacional fcq.quimica.central@uce.edu.ec
facultad de ciencias químicas química central
universidad central del ecuador 2021, vol 7(2), julio-diciembre, pp. 20-31
abstract
Mucopolysaccharidosis are rare, low prevalence diseases and are of lysosomal deposit. ey are produced
by the accumulation of dierent types of glycosaminoglycans due to the genetic defect that produces the
absence of the respective enzymes for their degradation. We propose biochemical tests for the screening
and timely diagnosis of mucopolysaccharidosis for the ecuadoran population at risk. Spectrophotometry
with dimethyl methylene blue reagent was used to determine concentrations of glycosaminoglycans in uri-
ne samples, from patients with mucopolysaccharidosis diagnosis and healthy patients. Agarose gel electro-
phoresis was used to classify the type of mucopolysaccharidosis. In the present investigation we determined
the concentration of glycosaminoglycans in urine samples, with a statistically signicant dierence between
healthy patients and patients with a diagnosis of MPS. However, the electrophoresis technique did not allow
classifying the various types of mucopolysaccharidosis. e concentrations of glycosaminoglycans in pa-
tients with mucopolysaccharidosis are higher than those of healthy patients, therefore the technique is valid
for the determination of glycosaminoglycans. Spectrophotometry with dimethyl methylene blue is suitable
for the screening and diagnosis of mucopolysaccharidosis. e methodology used for the correct classi-
cation of the type of mucopolysaccharidosis, by electrophoresis in agarose, did not give conclusive results.
resumen
Las mucopolisacaridosis son enfermedades raras, de baja prevalencia y de depósito lisosomal. Se produ-
cen por la acumulación de diferentes tipos de glucosoaminoglicanos debido al defecto genético que pro-
duce la ausencia de la enzima respectiva para su degradación. En el presente trabajo se proponen pruebas
bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis para población ecuatoria-
na en riesgo. Se utilizó el método espectrofotométrico con azul de dimetil metileno para determinar las
concentraciones de diferentes glucosaminoglicanos en muestras de orina de pacientes diagnosticados
con mucopolisacaridosis y pacientes sanos. Se realizó la electroforesis en gel de agarosa para clasicar el
tipo de mucopolisacaridosis. Se obtuvo la concentración de glucosaminoglicanos en muestras de orina,
con una diferencia estadísticamente signicativa entre pacientes con diagnóstico de mucopolisacarido-
sis y pacientes aparentemente sanos. Sin embargo, la técnica de electroforesis no permitió clasicar los
diversos tipos de mucopolisaridosis. Las concentraciones de glucosaminoglicanos de pacientes con mu-
copolisicaridosis son más elevadas que las de pacientes aparentemente sanos por lo que la técnica es vá-
lida para la determinación de glucosaminoglicanos por el método espectrofotométrico de azul de dimetil
metileno, y sirve para realizar el tamizaje y diagnóstico de mucopolisacaridosis. La clasicación del tipo
de mucopolisacaridosis por electroforesis en agarosa, no brindó resultados concluyentes.
introducción
Las mps, enfermedades de depósito lisosomal, son erro-
res innatos del metabolismo (eim) debido a los gag que
se acumulan por el décit de por lo menos una de las 11
enzimas que degradan a estos polisacáridos sulfurados.
Los gag son polímeros lineales formados por unidades
repetidas como son los disacáridos, de carácter ácido.
Generan la matriz extracelular, formando moléculas de
mayor complejidad como los proteoglicanos (Lin et al.,
2019; Stapleton et al., 2018; Kobayashi, 2019; Kubaski
et al., 2020a, Wilson et al., 2018). Estos compuestos son
degradados por enzimas especícas que, en caso de pre-
sentarse en menor concentración, producen una acumu-
historial del artículo
Recepción: 31/08/2021
Aceptación: 15/12/2021
pal abras clave
Mucopolisacaridosis, MPS, glicosami-
noglicanos, GAG, tamizaje, diagnóstico.
article history
Received: 13/08/2021
Accepted: 21/12/2021
key words
Mucopolysaccharidosis, MPS, glyco-
saminoglycans, GAG, screening, diag-
nosis.
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lación a nivel de los lisosomas, y cuya concentración en
exceso es excretada por la orina. Las mps son enferme-
dades genéticas (González Andrade et al., 2017) que se
transmiten como enfermedades autosómicas recesivas y
ligadas al cromosoma X, como el síndrome de Hunter.
La acumulación sistemática de gag, como del heparán
sulfato, dermatán sulfato, condroitín sulfato, y/o quera-
tán sulfato se asocia con síndromes clínicos especícos
(Poswar et al., 2019).
Las formas más sencillas se caracte-
rizan por anormalidades de los huesos y enanismo, dete-
rioro progresivo cardiopulmonar y muerte en el período
de la infancia o adulto joven. Las formas más progresivas
pueden desarrollar retardo mental y se presentan con
un retardo en el desarrollo, facies especícas y anorma-
lidades de los huesos (Kubaski et al., 2020b). Por otro
lado, las funciones auditivas, visuales y cardiovasculares,
como la movilidad articular pueden estar comprometi-
das (Kobayashi, 2019).
El retardo mental es característico
de la mps tipos i, ii y iii. El manejo de soporte y paliativo
para las complicaciones respiratorias y cardiovasculares,
como auditivas e hidrocefalia, pueden mejorar notable-
mente la calidad de vida de estos pacientes y sus familias.
Las mps aparecen, en la mayoría de los casos, du-
rante la infancia sin síntomas clínicos evidentes al
momento del nacimiento. Los pacientes con mps de-
muestran un rango amplio de síntomas multistémi-
cos con un curso crónico y progresivo, debilitando
al sistema óseo y cardiopulmorar, cornea, piel, híga-
do, cerebro y meninges (Gomes Bicalho et al., 2011).
Los tratamientos han demostrado que son
más efectivos cuando más temprano se realice el
diagnóstico. Existen varias alternativas terapéuticas
para tratar las mps, como el reemplazo enzimático,
trasplante de médula ósea, trasplante de sangre de
cordón umbilical, terapia y edición génica (Kubas-
ki et al., 2020a).
Los gag se determinan por varios
métodos (Lin et al., 2019; Colón et al., 2017; Kubas-
ki et al., 2020b).
Los pacientes de la población ecuatoriana diag-
nosticados con mps lo han sido en laboratorios de
fuera del país, como es el caso de pacientes de la Fun-
dación Fepel Dasha. En los laboratorios de diag-
nóstico del Ecuador no se han comprobado estas
pruebas, por tanto, se limita el acceso al diagnóstico
a todos aquellos pacientes que presentan mayor ries-
go de desarrollar estas enfermedades genéticas mps.
El laboratorio de Docencia de Análisis Clínicos de
la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
Central del Ecuador (uce), cuenta con los equipos
y los profesionales (bioquímicos clínicos) para rea
-
lizar y validar las pruebas para diagnosticar las mps.
El objetivo es proponer pruebas bioquímicas
para el diagnóstico oportuno de mps desde el la-
boratorio clínico de la Facultad de Ciencias Quí-
micas, uce.
parte experimental
MATERIALES Y REACTIVOS
Los equipos utilizados fueron: equipo de espectrofo-
tometría Fisher Scientic SP-2100UVPC y equipo de
electroforesis horizontal biostep gelco GH200 series;
además de los reactivos 1,9-Dimethyl-Methylene Blue
Zinc Chloride Double Salt Dye Content grado p.a. pure-
za > 80% (1 g); etanol grado p.a. pureza 96% (1 L); acido
fórmico (100 mL); formiato de sodio (250 g); condroi-
tin sulfato (500 mg), dermatán sulfato (25 mg); hepa-
rán sulfato proteoglicano (1 mg); gel de agarosa (100 g);
tampón tae (10X) (1 L) (Tris base, 48,4 g; ácido acético
glacial, 11,4 mL; 0,5 M EDTA pH 8; 20 mL); tampón de
carga (40% Sacarosa, 4 g; 3% glicerol, 3 mL; 0,025% azul
bromofenol, 25 mg); agua destilada; azul de Coomassie
(0,25g); metanol grado p.a. pureza 96% (90 mL) y ácido
acético glacial (10 mL).
MÉTODOS
Se realizó la validación de las pruebas de bioquímicas
de gag en espectrofotometría con el reactivo dbm. El
método utilizado se basó en una patente (Sampedro et
al., 2015).
Se desarrolló la validación de las pruebas de ta-
mizaje y diagnóstico de laboratorio clínico al de-
terminar la concentración de gag en muestras de
pacientes que presentan los diferentes tipos de mps,
y que pertenecen a la fundación Fepel Dasha y con
pacientes aparentemente sanos, estudiantes de la uce
(grupo control) que se atendieron en el laboratorio
clínico de la Facultad Ciencias Químicas, uce. Otros
colaboradores fueron, el laboratorio docente de Aná-
lisis Clínico y Fundación Fepel Dasha y sus pacien
-
tes con diagnóstico de mps. Para el grupo de estudio,
el criterio de inclusión fue el diagnóstico previo de
mps (realizado en laboratorios extranjeros ya que en
nuestro país no se realiza esta prueba) mientras que
para el grupo control el criterio de inclusión fue ser
estudiantes aparentemente de la uce que acudieron
al servicio de laboratorio clínico.
El objetivo de la presente investigación no fue
diagnosticar a los pacientes, sino utilizar las mues-
tras de los pacientes diagnosticados con algún tipo
de mps (se utilizó muestreo no probabilístico por
conveniencia, pacientes de la Fundación Fepel Das-
ha diagnosticados con un tipo de mps, muestra dis-
ponible en el periodo de tiempo de la investigación).
No fue necesario realizar un emparejamiento y ce-
gamiento de los pacientes que intervinieron en la inves-
tigación ya que ésta no fue un estudio epidemiológico.
Se aplicó consentimiento informado, documento r-
mado por el paciente o su representante. El representante
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del paciente rmó la declaración de condencialidad co-
nociendo que toda información de los pacientes será ma-
nejada con absoluta confidencialidad por parte de los
investigadores, y que los datos de liación serán utilizados
exclusivamente para garantizar la veracidad de los mismos.
Determinación de concentración de gag en orina, por el
método espectrofotométrico con dmb
Con ayuda del analizador Fisher Scientic SP-
2100UVPC, localizado en el Laboratorio de Análisis
Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Uni-
versidad Central del Ecuador, se prepararon soluciones
acuosas de concentraciones de gag de 10, 25, 50 y 100
μg/mL de condroitin sulfato, dermatán sulfato y heparán
sulfato de la casa comercial Sigma Aldrich, midiendo su
absorbancia con la disolución de azul de dimetilmetileno
(dmb), de 0,35 mmol/L disuelto en etanol y en tampón
formiato de sodio. Posterior a ello, se procedió a leer la
absorbancia del complejo dmb-gag de cada estándar y
las muestras de orina de pacientes con mps de diferentes
tipos, a condiciones óptimas de pH 4, longitud de onda
528 nm, tiempo de reacción 5 minutos, y temperatura
ambiente en un rango de 20-25ºC. El rectivo dmb es ca-
paz de unirse especícamente a los gag sulfatados debi-
do a la carga negativa de éstos. Se calcula por medio de
la ley de Beer la concentración de gag comparando con
la concentración de los estándares (Aranzadi et al., 2002;
Cueva, 2019).
Procedimiento con prueba de azul de dimetilmetileno
(dmb) por electroforesis en gel de agarosa.
Para la clasicación del tipo de mps, se preparó el gel de
agarosa. Pesar 0,4 g de agarosa, cantidad necesaria para
obtener la concentración deseada 0,8% en función del
volumen de gel aproximadamente de 10 x 10 cm ajustan-
do a 50 mL con el buer para la electroforesis. Se calentó
la mezcla en un horno de microondas por un minuto,
hasta observar que toda la agarosa se ha fundido. Se
procedió a enfriar la solución de agarosa hasta una tem-
peratura de unos 50°C. Mientras la solución de agarosa
se enfría, se prepara el molde en el que se va a elaborar
el gel, sellando los bordes, colocándolo en el dispositivo
previsto para ello, y colocando el peine en la posición de-
seada. Se vierte cuidadosamente la solución de agarosa
sobre el molde nivelado y se deja que solidique durante
al menos 30 min. Una vez que el gel se solidicó, se pro-
cedió a retirar el sellado de los bordes y colocar el molde
con el gel en la cámara de electroforesis. Luego, se pin-
chó cuidadosamente con el peine para que queden libres
los pocillos para lo cual se depositaron las muestras (la
solución del gel de agarosa presentó un pH cercano a 8,3
sin necesidad de ajustarla).
Preparación del buer de corrida para la electroforesis
Para la solución tae 10X, se pesó Tris base, 48,4 g; se usó
ácido acético glacial, 11,4 mL; 0,5 M edta pH 8, 20 mL y
se ajustó a 1 L con agua bidestilada. Se tomó una alícuota
de 50 mL del buer para la electroforesis y se llevó a 1 L
con agua bidestilada hasta tener un tae 0,5X. Esta solu-
ción se añadió luego en la cámara de electroforesis hasta
que cubra el gel unos 3-5 mm. El edta se preparó previa-
mente, añadiendo al agua bidestilada (un volumen 20%
inferior al volumen nal deseado) la cantidad de 18,61
g de edta y se disolvió en 70 mL de agua destilada para
obtener una concentración nal de 0,5 M. Se ajustó el pH
con NaOH hasta obtener una solución pH 8. Se ajustó el
volumen a 100 mL. El tae se diluyó con agua destilada
antes de cada electroforesis para lograr la concentración
de uso de 0,5X. Se procedió a vericar con un potenció-
metro el pH de la solución amortiguadora, la misma que
tuvo un pH cercano a 8,3 sin necesidad de ajustarla. En la
electroforesis, el amortiguador ejerce dos funciones: por
un lado, lleva la carga eléctrica y, por otro, determina la
carga neta de las moléculas que se separan.
Preparación de las muestras y estándares.
Se precipitó 50 µL de las muestras de orina y con los
diferentes estándares con 1000 µL de dmb por 5 min a
20-25°C, y se procedió a centrifugar a 10.000 g duran-
te 10 minutos, luego se descartó el sobrenadante. Con el
precipitado que quedó, se mezcló 100 µL con un buer
de carga (6X); 0,025% azul de bromofenol, 25 mg; 40%
sacarosa, 4 g; o 3% glicerol, 3 mL y ajustar a 10 mL con
agua destilada. El volumen total estuvo determinado por
el tamaño de los pocillos, habitualmente de 10 µL. (An-
tes de cargar la muestra de orina, previamente agitar. Se
almacenaron los buers bajo refrigeración para evitar el
crecimiento de hongos entre 2 y 8°C.)
Carga de las muestras y estándares en el gel de electroforesis
Se cargaron en los pocillos las muestras que se pre-
pararon. Al momento de sumergir las muestras en la
cámara de electroforesis, se aseguró que los pocillos
del gel estaban totalmente cubiertos por el buer. Se
procedió a conectar los cables a la fuente de alimen-
tación, uno positivo y otro negativo (frecuentemen-
te representados por colores rojo y negro, respecti-
vamente), y se aplicó un voltaje de 80 V con un valor
de corriente aproximado 40 mA durante 1 h 30 mi-
nutos. Se tuvo en cuenta que los gag migraron hacia
el cátodo, por lo que debe disponerse correctamente
la orientación del gel y de los cables. Se realizó la
electroforesis hasta que el frente de corrida (visuali-
zado como una línea azul por el colorante del buer)
llegó a los límites de la parte inferior a un 25% apro-
ximadamente 40 a 60 minutos de la longitud total
del gel. En ese momento se detuvo la electroforesis.
Finalizada la electroforesis se procedió al desmonta-
je del equipo, se desconectaron los electrodos de la
fuente de poder ya apagada y se removió el sistema
que contiene el gel de agarosa. Se enjuagaron con
agua destilada todos los componentes de electrofo-
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resis al terminar la corrida. Se procedió a reutilizar
el buer de electroforesis hasta 6 veces.
Tinción del gel y visualización
Terminada la electroforesis, se realizó la tinción, y para
ello se sacó el gel de su molde cuidadosamente; se su-
mergió luego en una disolución azul de Coomasie; 0,25
g en 90 mL de metanol (96%): H
2
O (v/v 1:1) y 10 mL
de ácido acético glacial y con suave movimiento rotato-
rio, durante 5 minutos. Se realizó la coloración del gel
por más de dos horas, debido a que el colorante puede
quedar retenido fuertemente en el gel generando un fon-
do oscuro por sobre tinción que impediría la visualiza-
ción de los gag. Se procedió a ltrar la solución de azul
de Coomasie a través de un papel Whatman n.° 1 para
eliminar los residuos extraños; antes de usar se dejó en
reposo por una semana en un frasco oscuro. Culminado
el tiempo de incubación, se depositó el colorante en el
frasco original. Finalizada la tinción, se sumergió en una
disolución preparada de decoloración lenta (10 mL de
ácido acético 10% más 5 mL de metanol más 85 mL agua
destilada), o en una disolución de decoloración rápida
(10 mL de ácido acético 10% más 50 mL de metanol más
40 mL agua destilada), durante 24 a 48 horas. Se lavó el
gel para quitar los residuos que dejó el colorante y no se
jó a las moléculas, luego se lavó con agua destilada para
frenar la decoloración.
Se retiró el colorante con movimiento constante, y se
cambió la solución por una nueva (esto de lo hace cuan-
tas veces sea necesario según el desteñido). Se procedió
a seguir destiñendo hasta que las bandas de los gag se
apreciaron claramente. El ácido acético puede ser utili-
zado en concentraciones de 5% o 10%. Los gag se visua-
lizaron como bandas y se compararon con los estándares.
resultados y discusiones
Se evidenció que la disolución de dmb, de la casa comer-
cial de Sigma Aldrich, se debe preparar a una concentra-
ción de 0,35 mmoL/L preferiblemente disuelto en etanol
y en tampón formiato de sodio, para que la absorbancia
aumente conforme se va formando el complejo dmb-gag
de cada estándar y muestra, teniendo una relación lineal
en función de la Ley de Beer, y al límite de cuanticación
de los estándares, lo que condujo a condiciones óptimas
de pH 4, longitud de onda 528 nm, tiempo de reacción 5
minutos, y temperatura ambiente en un rango de 20-25ºC;
condiciones en las cuales es capaz de unirse especíca-
mente a los gag sulfatados debido a su carga negativa.
Estos valores fueron comparados y se obtuvieron re-
sultados similares en relación con los indicados por el
autor De La Cruz (De la Cruz Amorós et al., 1999) (ver
Tabla 1).
Los cálculos de los parámetros estadísticos para la de-
terminación de concentración de gag con los estánda-
res (Tabla 2; Tabla 3) muestran las curvas de calibración,
donde se midió la señal de respuesta por triplicado de
cuatro soluciones con concentraciones espaciadas en
forma independiente (n = 12) a lo largo del intervalo 10,
25, 50 y 100 μg/mL para cada gag. Los resultados fueron
expresados como valores medios y al aplicar la prueba
de hipótesis con anova de un solo factor, existe diferen-
cias estadísticamente signicativas, con un intervalo de
conanza del 95% (p < 0,05) (dos colas y 3 grados de li-
bertad), por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acep-
ta la hipótesis alternativa, demostrando que sí se puede
obtener la concentración de gag en muestras de orina,
de esta manera se puede comparar con el rango de refe-
rencia, se encuentran concentraciones superiores o in-
feriores al límite de cuanticación. De igual manera, los
resultados de la gura 1 evidencian un comportamiento
de una manera aproximadamente normal demostrada
con la prueba de normalidad de Kolmolgorov-Smirnov,
Anderson-Darling y Ryan-Joiner, por el modelo de re-
gresión de los mínimos cuadrados, aplicándose un ajuste
lineal de dispersión obtenido en cada una de las curvas,
y estableciéndose con los valores máximos y mínimos
como se distancian respecto de la media con un interva-
lo de conanza del 95% (p < 0,05) en aquellas variables
cuantitativas en las que se realizó dicho ajuste, que en
función de un pH entre 3 y 6 se tiene un mejor com-
portamiento con una clara diferencia de los máximos de
absorbancia en los que presentaban los complejos dmb-
gag. El autor De la Cruz obtuvo resultados de absor-
bancia máximas en muestras en pH entre 3 y 6. Para la
precisión, los coecientes de variación fueron de 0,61%
para coindroitin sulfato, 0,59% para dermatán sulfato
y 0,97% para heparán sulfato. Los límites de detección
que se obtuvieron fueron de 0,11 μg/mL para coindroitin
sulfato, 0,08 μg/mL para dermatán sulfato y 0,14 μg/mL
para heparán sulfato, comparándose con las concentra-
ciones de las muestras de orina que fueron mayores a los
límites de detección, indicando que el método es válido.
Se puede decir que el intervalo de concentración de las
curvas de calibración fue de 10 y 100 μg/mL para cada
gag. 0,0142 A/μg/mL para coindroitin sulfato, 0,0090 A/
μg/mL para dermatán sulfato y 0,0158 A/μg/mL para he-
parán sulfato, que corresponde a la pendiente de la recta
de calibración, indicando que el método es sensible y se
puede determinar gag (ver Tabla 2 y Figuras 1, 2, 3 y 4).
En la actualidad los pacientes son diagnosticados en
países extranjeros. Generalmente son atendidos cuan-
do la enfermedad ya ha avanzado en su desarrollo, en la
mayoría de los casos solo se aplican cuidados paliativos,
comprometiendo la salud del paciente, el bienestar y la
economía familiar, pese a que la Ley Orgánica de la Salud
protege y garantiza su diagnóstico y tratamiento
(Gon-
zález Andrade et al., 2017) (ver Tabla 3 y Figuras 5 y 6).
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Tabla 1. Programación del analizador Fisher Scientic sp-2100uvpc para determinar gags
General
Modo de medición Absorbancia
Modo de reacción uv-vis
Modo de calibración Regresión lineal
Blanco Azul de dimetilmetileno
Longitud de onda 528 nm
Temperatura 20-25°C
Unidades µg/mL
Análisis
Volumen de muestra 50 µL
Reactivo Azul de dimetilmetileno
Volumen 1000 µL
Tiempo de incubación 5 minutos
Cálculos
Dirección de la reacción Incremento
Cálculo Punto nal
Calibración
Intervalo de calibración Cada corrida
Número de estándares 4
STD1: 10
STD2: 25
STD3: 50
STD4: 100
uv-vis: luz de visibilidad ultravioleta, nm: nanómetros, ug: microgramos, ml: mililitros uL: microlitros, std: estándar.
Tabla 2. Valores medios de absorbancia reales de las soluciones estándar para el condroitin sulfato y prueba de precisión, límite de detección,
linealidad, sensibilidad y correlación
Solución de chondroitin sulfato (μg/mL) Absorbancia
10 0,411
25 0,421
50 0,445
100 0,544
Promedio 0,455
sd 0,003
cv (%) 0,61
ld (μg/mL) 0,11
Linealidad (μg/mL) 10 a 100
Sensibilidad (A/μg/mL) 0,0142
Correlación 0,9637 p < 0,018
μg: microgramos, mL: mililitros, sd: desviación estándar. cv: coeciente de variación, ld: límite de detección.
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25
0,0300,0150,000-0,015-0,030
99
90
50
10
1
Residuo
Porcentaje
0,550,500,450,40
0,01
0,00
-0,01
Valor ajustado
Residuo
0,0100,0050,000-0,005-0,010-0,015
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
Residuo
Frecuencia
4321
0,01
0,00
-0,01
Orden de observación
Residuo
Gráfica de probabilidad normal vs. ajustes
Histograma vs. orden
Gráficas de residuos para Chondroitin sulfato (μg/mL)
Figura 1. Línea ajustada chondroitin sulfato (μg/mL)
Figura 2. Residuos de chondroitin sulfato (μg/mL).
Figura 4. Línea de residuos para dermatán sulfato (μg/mL).
Figura 3. Línea ajustada para dermatán sulfato (μg/mL).
1
00
8
0
6
0
4
0
2
0
0
0,56
0
,54
0
,52
0
,50
0
,48
0
,46
0
,44
0
,42
0
,40
S 0
,0141737
R
-cuad.
9
6,4%
R
-cuad.(ajustado)
9
4,5%
C
hondroitin sulfato (μg/mL)
Absorbancia
G
ráfica de línea ajustada para Chondroitin sulfato (μg/mL)
Y
CS = 0,3854 + 0,001510 XCS
100806
0
4
0
2
0
0
0,44
0
,
4
2
0
,
4
0
0
,
3
8
0
,
3
6
0
,
3
4
0
,
3
2
S 0
,
0
086079
R
-
c
uad.
9
7
,
3%
R-cuad.(ajustado) 95,9%
Dermatán sulfato (μg/mL)
Absorbancia
G
rá
f
ica de línea ajustada para Dermatán sulfato (μg/mL)
YDS = 0,3186 + 0,001069 XDS
0
,
0
2
0
,
0
1
0
,
0
0
-
0
,
0
1
-
0
,
0
2
9
9
90
5
0
1
0
1
Residuo
Porcentaje
0
,
4
2
0
,
4
0
0
,
3
8
0
,
3
6
0
,
3
4
0,010
0
,
0
0
5
0
,
0
0
0
-0,005
-0,010
Valor ajustado
R
esiduo
0
,
0
1
0
0
,
0
0
5
0
,
0
0
0
-
0
,
0
0
5
-
0
,
0
1
0
2
,
0
1
,
5
1
,
0
0
,
5
0
,
0
R
e
s
i
d
u
o
Frecuencia
4321
0,010
0
,
0
0
5
0,000
-
0
,
0
0
5
-
0
,
0
1
0
O
r
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n
d
e
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b
s
e
r
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a
c
ió
n
R
esiduo
Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis de población en riesgo
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Tabla 3. Valores de absorbancia reales de las soluciones estándar para el heparán sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad,
sensibilidad y correlación
Solución de heparán sulfato (μg/mL) Absorbancia
10 0,355
25 0,364
50 0,372
100 0,454
Promedio 0,386
sd 0,004
cv (%) 0,97
ld (μg/mL) 0,14
Linealidad (μg/mL) 10-100
Sensibilidad (A/μg/mL) 0,0158
Correlación 0,9198 p < 0,041
μg: microgramos, mL: mililitros, A: absorbancia. sd: desviación estándar, cv: coeciente de variación, ld: límite de detección.
100806040200
0,450
0,425
0,400
0,375
0,350
S 0,0157999
R-cuad. 92,0%
R-cuad.(ajustado) 88,0%
Heparán sulfato (μg/mL)
Absorbancia
Gráfica de línea ajustada para Heparán sulfato (μg/mL)
YHS = 0,3349 + 0,001107 XHS
Figura 5. Línea ajustada para heparán sulfato (μg/mL)
Figura 6. Línea de residuos para heparán sulfato (μg/mL)
0,0300,0150,000-0,015-0,030
99
90
50
10
1
Residuo
Porcentaje
0,4500,4250,4000,3750,350
0,01
0,00
-0,01
-0,02
Valor ajustado
Residuo
0,0100,0050,000-0,005-0,010-0,015-0,020
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Residuo
Frecuencia
4321
0,01
0,00
-0,01
-0,02
Orden de observación
Residuo
Gráfica de probabilidad normal vs. ajustes
Histograma vs. orden
Gráficas de residuos para Heparán sulfato (μg/mL)
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Tabla 4. Frecuencia por grupos de edad/género para cada glucosaminoglicano con la prueba de dmb.
Edad Frecuencia
(n)%
Frecuencia masculina
(n)(%)
Frecuencia femenina
(n)(%)
18-19 97 (41) 25 (28) 72 (49)
20-34 138 (59) 63 (72) 75 (51)
Total 235 (100) 88 (37) 147 (63)
Concentración (μg/mL)
Edad condroitin sulfato dermatán sulfato heparán sulfato CV%
18-19 6,53 ± 0,002 8,36 ± 0,002
7,55 ± 0,002 0,74
20-34 6,48 ± 0,002 8,29 ± 0,002
7,50 ± 0,002 0,59
cv: coeciente de variación. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. anova: f = 7,22, p < 0,001.
Figura 7. Frecuencia de la población estudiada por grupos de edad
y género
Figura 9. Correlaciones entre variables. Concentración de GAGs, edad,
sexo, tratamiento. No existe correlación entre las variables, concentra-
ción de GAGs µg/mL- edad y sexo del paciente
Figura 10. Correlación entre Pacientes (con edad)
Figura 8. Valores de glucosaminoglicanos en muestras de orina con
la prueba de azul de dimetilmetileno según la edad. Mann-Whitney:
p < 0.017.
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Figura 11. Correlación entre pacientes (sin edad)
Figura 12. Correlación ACP con edad
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De acuerdo, a los resultados obtenidos de los exámenes
con muestras de estudiantes de la Universidad Central
del Ecuador con la prueba de azul de dimetilmetileno
(dmb) por el procedimiento de espectrofotometría para
la determinación de concentración de gag, (ver Tabla 4
y Figuras 7, 8, 9), en relación a pruebas bioquímicas con-
vencionales del laboratorio clínico, se observa valores
considerados normales, donde, se realizaron biometría
hemática, glucosa, urea, ácido úrico, colesterol, trigli-
céridos y creatinina, no evidenciándose la presencia de
enfermedades que pueden aumentar la excreción urina-
ria de gag, cómo tampoco en otros factores fenotípicos
como rasgos faciales toscos, por lo que, no fue necesario
la aplicación de la electroforesis para el tipo de mps, que-
dando así en procedimientos estandarizados para futu-
ras determinaciones.
De acuerdo con el valor de R (Stapleton et al.,
2018)
éste es signicativo, lo que indica que no afecta la
interpretación de variables signicativas. De esta manera
se comprueba la relación signicativa entre los gag y la
edad (ver Figuras 10, 11, 12).
El R
(Stapleton et al., 2018) indica que el modelo tiene
un buen ajuste y, al examinar la gráca de línea ajustada y
la gráca de residuos, muestra relación entre gag de pa-
cientes con mps y las edades de los pacientes.
Kubaski F. y su equipo de investigación realizaron la
determinación de gag en orina de pacientes con dife-
rentes tipos de mps y, de diferentes edades, encontrándo-
se que los valores varían por la edad y el tipo de mps (ver
Figuras 13.1, 13.2, 14, 15).
Sabir E.
y su equipo de investigación realizaron estu-
dios de concentración de gag por el método espectro-
fotométrico dmb en orina de pacientes con mps, además
realizaron investigaciones de estabilidad de las muestras
a diferentes temperaturas, lo que fue tomado en cuenta
para la presente investigación.
Se desarrollaron parámetros de linealidad, sensibili-
dad y correlación. En la determinación de la concentra-
ción de gag en orina de pacientes aparentemente sanos
que acudieron al laboratorio clínico de la Facultad de
Ciencias Química de la uce, lo que demuestra que exis-
te linealidad en los datos obtenidos por espectrofotome-
tría con el reactivo dmb. Se cumple con una distribución
homogénea, repetilibilidad en los datos y que se realizó
previamente el análisis de gag con muestras de pacien-
tes diagnosticados con mps.
Para realizar el análisis de la concentración de gag en
muestras de orina de pacientes diagnosticados con mps
se varió el tiempo de reacción del reactivo con los gag
presentes en la orina, y se encontró la absorbancia incre-
mentaba hasta el minuto 5 de la reacción indicando que
ésta se ha completado.
conclusiones
Se concluye que sí se puede medir concentraciones de
gag en muestras de orina, en relación al rango de refe-
rencia.
Los valores de gag de pacientes diagnosticados con
mps son signicativamente mayores a los pacientes sa-
nos. Los valores promedio de pacientes sanos comparados
con estándares de dermatán son 8,38 mg/mL, condroi-
tin 6,54 mg/mL, y con heparán 7,58 mg/mL. Los valores
de pacientes con mps iv (condroitin) fueron 9,64 mg/mL
comparados con pacientes sanos que fueron de 6,54 mg/
mL por lo que concluimos que los valores en los pacien-
tes con mps iv son signicativamente más altos. La meto-
dología utilizada para clasicar las diversas mps del país
fue por electroforesis horizontal con una temperatura de
25°C, de agarosa al 2,5%. No fue posible obtener la sepa-
ración de los gag para su correcta identicación. Los va-
lores de pacientes con mps ii (dermartán y heparán) son
7,90 a 16,98 mg/mL comparados con pacientes sanos, que
van de 7,58 a 8,38 mg/mL. Los pacientes con mps iii (he-
parán) son 8,58 a 8,81 mg/mL comparados con pacien-
tes sanos que tienen un valor de 7,58 mg/mL. Los valores
promedio de pacientes es de 8,38 mg/mL de dermatán en
los pacientes sanos. El promedio de 6,54 mg /mL de con-
droitín en los pacientes sanos. El promedio de 7,58 mg/
mL de heparán en los pacientes sanos. En las muestras de
pacientes con mps iv, se obtuvieron concentraciones lige-
ramente mayores de queratán y condroitín, 9,64 mg/mL
comparados con sanos 9,54 mg/mL. Adicionalmente se
obtuvo en mps ii, concentraciones mayores de dermatán
y heparán, desde 7,90 y 16,98 mg/mL, comparados con
sanos 7,58 y 8,38 mg/mL.
La metodología utilizada para clasicar los diferen-
tes tipos de mps por electroforesis horizontal a una tem-
peratura de 25°C, con agarosa al 2,5%, no dio resultados
analíticos concluyentes. No fue posible obtener la separa-
ción de los gag para su correcta identicación. Se repitió
este análisis con una estricta revisión del mismo, pero no
se obtuvieron datos válidos.
conflicto de intereses
Ninguno reportado por los autores.
agradecimientos y patrocinio
Se expresa un fraterno agradecimiento a la Universidad
Central del Ecuador, a la Dirección de Investigación, a
la Unidad de Investigación Formativa, Facultad de Cien-
cias Químicas, Fundación Fepel Dasha. Los autores de-
claran que los recursos nancieros para la elaboración de
la presente investigación proceden del fondo de investi-
gación semilla de la UCE.
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Figura 13.2. Correlación ACP sin edadFigura 13.1. Correlación ACP sin edad
Figura 14. GAG’s ug/ml. Promedio al IC 95% edad(años). El valor promedio de GAG’s y su intervalo de conanza son utilizados para el cálcu-
lo de R cuadrado.
Figura 15. R2. De acuerdo con el valor de R2 éste es signicativo, lo que indica que no afecta la interpretación de variables signicativas. De esta
manera se comprueba la relación signicativa entre los GAG’s y la edad. El R2 indica que el modelo tiene un buen ajuste y, al examinar la grá-
ca de línea ajustada y la gráca de residuos, muestra relación entre GAG’s de pacientes con MPS y las edades de los pacientes.
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