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QUÍMICA CENTRAL
i-issn 1390-5562 | e-issn 2477-9121 | año 2021 | volumen 7 | número 2
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Revista Química Central es una revista bianual de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador reedi-
tada en el año 2010 que tiene como objetivo difundir la actividad investigadora asociada a los campos de la Química, Ciencias de
la Vida, Ciencias de la Salud y campos anes, con compromiso ético y de alta responsabilidad social y ambiental.
Dr. Fernando Sempértegui Ontaneda, Ph. D.
Dra. María Augusta Espín, Ph. D.
Dra. María Mercedes Gavilánez, Ph. D.
,
Dra. Martha Suárez, Ph.D.
Martha Suárez Heredia
Alex Palma Cando —Universidad Tecnológica Experimental Yachay (Ecuador)
Patricio Espinoza Montero —Pontica Universidad Católica del Ecuador (Ecuador)
Marvin Ricaurte Fernández —Universidad Tecnológica Experimental Yachay (Ecuador)
Ulrich Rainer Stahl —Universidad Central del Ecuador (Ecuador)
Favio Idrobo Espín —Universidad Central del Ecuador (Ecuador)
Andrés Fullana —Universidad de Alicante (España)
Juan Antelo —Universidad de Santiago de Compostela (España)
Giovanni Carabalí Sandoval —Universidad Nacional Autónoma de México (México)
Carlos Salazar Camacho —Universidad Técnica del Chocó (Colombia)
Katherine Vaca Escobar —Investigadora Senescyt (Ecuador)
Pablo Cisneros Pérez —Universidad (Ecuador)
William Calero Cáceres —Universidad Técnica de Ambato (Ecuador)
Pablo Bonilla Valladares —Universidad Central del Ecuador (Ecuador)
Verónica Sánchez Peralta —Universidad Central del Ecuador (Ecuador)
Año 2021, vol. 7, n.° 2.
Frecuencia: bianual
p: 1390-5592
e: 2477-9121
Año de inicio: 2010
Idioma: español
fcq.quimica.central@uce.edu.ec
https://revistadigital.uce.edu.ec/index.php/
Ciudadela Universitaria, Jerónimo Leyton y Gatto Sobral
A. P. 17-03-1369, Quito-Ecuador
+593 2 3216 975 / +593 2 2523 710 / +593 2 2500 409
Edición general | Gustavo Pazmiño
Diseño y diagramación | Christian Echeverría
Corrección de textos | Marcelo Acuña
Portada | Christian Echeverría
Editorial Universitaria, 2021
Ciudadela Universitaria, av. América, s. n.
Quito, Ecuador
+593 (02) 2524 033
editorial@uce.edu.ec
Los contenidos pueden usarse libremente, sin nes comerciales y siempre y cuando se cite la fuente. Si se hacen
cambios de cualquier tipo, debe guardarse el espíritu de libre acceso al contenido.
Presentación ............................................................................................................................................................................................................................................ 4
Uso de la nanotecnología para el desarrollo de empaques alimenticios del sector pesquero ........................................... 5
Dennys Almachi
| Pablo Bonilla
Validación del método de cuanticación de lignina en biomasa de pino .................................................................................. 15
Lenin Márquez
| Paola Cuji
| Carlos Méndez | Diego Flores
Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis
de población en riesgo ............................................................................................................................................................................................. 20
Walkyrie Aguilar (†)
| Guadalupe Jibaja
| Lourdes Pazmiño
Evaluación de la actividad nootrópica del ácido clorogénico presente en el café para
el tratamiento preventivo de enfermedades neurodegenerativas ................................................................................................... 32
Elda Molina
| Elithsine Espinel
| Dayana Borja | Javier Santamaría | Carmita Reyes | Jorge Grijalva | Roy Vera
Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro
para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios .........................................................................................40
Andrea Parreño
Nanoemulsion de liberación controlada de ibuprofeno con lecitina de soya .......................................................................... 44
Pablo Bonilla
| Mariel Bonilla
Instrucciones para los autores ..........................................................................................................................................................50
4
Desde la historia de las ideas podemos decir que muchos de los progresos materiales como las innovaciones, entre
otras, en la medicina, la farmacología y la cosmetología, han aportado comodidad y libertad al ciudadano. Muchos
de estos aportes son ahora bienes considerados del contexto, como lógicamente prexistentes y cuyo valor es más bien
monetario, de consumo. Sin embargo, la producción cientíca y tecnológica es un proceso que exige grandes esfuer-
zos y dedicación, cuyos resultados han brindado, en última instancia, facilidades y mayor libertad de acción para el
beneciario directo de estas ventajas.
La muestra que se presenta en la revista Química Central busca, en último término, contribuir al sostenimiento de la
democracia, aquella de las libertades sociales y políticas en el marco de la seguridad que brinda el avance de resultados
obtenidos en el país.
Desde la cuanticación directa de histaminas, que garantizará un producto alimenticio seguro e inocuo para los
consumidores y la multifuncionalidad química de la lignina cuya experimentación permitirá ser replicada a futuro
en diferentes investigaciones nacionales, pasando por la identicación de la actividad nootrópica en el extracto de
la pulpa de café y la aplicación del método espectrofotométrico de azul de dimetil metileno que sirve para realizar
diagnóstico de mucopolisacaridosis, hasta la revisión de la gran utilidad que presta el ensayo del disco de papa, y la
seguridad en el empleo del principio activo bajo una cinética de liberación controlada para nanoemulsiones de tipo
O/W; todos estos trabajos de investigación son aportes tanto a la medicina como a la industria farmacéutica, cosme-
tológica y química del país.
Finalmente, estos avances son ventajas obtenidas como fruto de las innovaciones cientícas y tecnológicas basadas en
la observación, experimentación y deducción. Al interior de estos trabajos, se hacen presentes la revisión cientíca y
el diseño experimental como los ejes que sostienen el aporte con el que la revista Química Central desea incrementar
el desarrollo nacional en democracia. Esta orientación última es la que hace al experimento una idea tan importante.
La práctica del método cientíco, aparte de otras abstracciones, es probablemente la forma más directa de democracia
en acción.
Martha Suárez Heredia
Uso de la nanotecnología para el desarrollo de empaques alimenticios del sector pesquero
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REVISTA QUÍMICA CENTRAL
Uso de la nanotecnología para el desarrollo de empaques alimenticios del sector pesquero
Use of nanotechnology for the development of food packaging in the shing sector
Dennys Almachi
a
| Pablo Bonilla
b
a
Universidad Central del Ecuador; dpalmachi@uce.edu.ec
b
Universidad Central del Ecuador; pmbonilla@uce.edu.ec
DOI: 10.29166/10.29166/quimica.v7i2.3270 ISSN impresa 1390-5562
© 2021 Universidad Central del Ecuador ISSN electrónica 2477- 9121
Creative commons NoComercial 4.0 Internacional fcq.quimica.central@uce.edu.ec
, (), -, . -
In the present review article, it was analyzed the proposal to develop food packaging functionalized with
quantum carbon dots () for the shing sector in order to allow the direct quantication of histami-
nes (). e search engines Science Direct, Wiley, Publication, Pubmed, Royal Society of Chemis-
try, SpringerLink, Igenta Connect, Plos One, Dovepress, Taylor and Francis were considered, and only
four investigations were found that quantied HIS through . erefore, this analytical methodology
for the development of intelligent packaging was considered. However, it was determined that this pro-
posal, possibly could not be made because histamines are concentrated in the shellsh muscle. Likewise,
the antibacterial activity of was considered, and it was found that several investigations demonstra-
te the elimination of three -producing bacteria such as Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and
Klebsiella pneumoniae. Consequently, the packages functionalized with , would be a disruptive inno-
vation since they could avoid the formation of , guaranteeing a safe, non - toxic, and harmless pro-
duct to the consumers..
En el presente artículo de revisión, se analizó la propuesta para desarrollar un empaque alimenticio para
el sector pesquero funcionalizado con puntos cuánticos de carbono (), que permita la cuanticación
directa de histaminas (). Se consideraron los buscadores Science Direct, Wiley, Publication, Pub-
med, Royal Society of Chemistry, SpringerLink, Igenta Connect, Plos One, Dovepress, Taylor y Francis
y se encontraron solamente cuatro investigaciones que cuanticaron a través de los . Por lo tan-
to, se consideró esta metodología analítica para la elaboración del empaque inteligente; sin embargo, se
determinó que la propuesta, posiblemente no se podría realizar debido a que las se concentran en
el músculo del marisco. De igual manera, se consideró la actividad antibacterial de los y se encon-
traron varias investigaciones que demuestran la eliminación de tres bacterias productoras de como
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae. Por lo tanto, los empaques funcionali-
zados con serían una innovación disruptiva, ya que podrían evitar la formación de , garantizan-
do un producto seguro e inocuo a los consumidores.
En la gura 1 se observan algunas aminas biogénicas
(). La espermidina y espermina tienen importantes
funciones siológicas relacionadas con el crecimiento y
la proliferación celular.
(1)
Al contrario, la acumulación
de genera toxicidad para el ser humano, por ejemplo,
las diaminas, como la putrescina y cadaverina, pueden
potenciar la absorción de aminas vasoactivas debido a
la saturación de las barreras intestinales,
(2)
pueden reac-
cionar con el ion nitrito para formar nitrosaminas que
son cancerígenas.
(3)
Además, la intoxicación con hista-
minas () puede ocasionar erupción cutánea, urtica-
ria, dolor de cabeza, diarrea, vómitos, irregularidades en
la frecuencia cardíaca
(4)
y representa el 39% de los brotes
Recepción: 23/08/2021
Aceptación: 20/12//2021
Puntos cuánticos de carbono, histami-
nas, actividad antibacterial.
Received: 23/08/2021
Accepted: 20/12/2021
Quantum carbon dots, histamines,
antibacterial activity.
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asociados con mariscos en los Estados Unidos (ver Fi-
gura 1).
(5)
La formación de BA se debe a la acción de enzimas
amino descarcarboxilasas () que provienen de bacte-
rias Gramnegativas como Acromonas hydrophila, Escheria
coli, Klebsiella spp., Hafnia alvei, Pseudomonas sp., Pro-
teus morganii, Serratia spp., y Vibrio alginolyticus
(6)
. Por
lo tanto, la cuanticación de es un parámetro impor-
tante para determinar la calidad e inocuidad de alimen-
tos del sector pesquero.
Las una vez formadas pueden seguir producien-
do a temperaturas entre 0-5°C, debido a que la acti-
vidad de las es independiente de la temperatura. La
problemática aumenta porque las no alteran las pro-
piedades organolépticas de los mariscos
(7)
y no se destru-
yen por la cocción o fritura por ser termoestables.
(8)
Por
lo tanto, La Unión Europea ha establecido un límite mí-
nimo de 100 ppm y un límite máximo de 200 ppm para
, en familias de pescados Scombridae, Clupeidae, En-
graulidae, Coryfenidae, Pomatomidae y Scombresosidae,
además, indica que el método analítico de referencia es la
cromatografía líquida de alta ecacia ().
(9)
Se debe considerar que la cuanticación de por
tendría costos signicativos para las industrias del
sector pesquero, debido a que se requieren reactivos de
alta pureza, personal técnico calicado, adquisición del
equipo con sus respectivos accesorios; además, en el pro-
ceso se generan residuos orgánicos que necesitan trata-
miento. Por lo tanto, se deberían considerar los recientes
avances en nanotecnología para la cuanticación de ;
por ejemplo, en los puntos cuánticos de carbono ();
se ha observado una modicación de la uorescencia en
presencia de , es decir, una respuesta analítica para su
respectiva cuanticación.
(10, 11,
12,13)
Por otra parte, se ha demostrado que los tienen ac-
tividad antibacterial, debido que se pueden impregnar en la
membrana celular; provocando irregularidades y la poste-
rior fuga de componentes intracelulares. Los también
pueden ingresar a la célula y formar enlaces no covalen-
tes con el para alterar su conformación secundaria.
(14)
Considerando lo antes mencionado, esta revisión bi-
bliográca tiene como objetivo analizar la viabilidad para el
desarrollo de empaques funcionalizados con para ali-
mentos del sector pesquero, los cuales permitirían la cuan-
ticación de de forma directa, y posiblemente evitar la
formación de histaminas (), considerando la actividad
antibacterial de los puntos cuánticos de carbono ().
Los puntos cuánticos () son nanocristales semiconduc-
tores que tienen tamaños entre 1,5 nm y 10,0 nm; esto
equivale a la unión de aproximadamente 100 a 10.000
átomos.
(15)
Por lo tanto, al encontrarse en la escala na-
nométrica, se rigen por las leyes de la mecánica cuántica
(16)
y brindan excelentes propiedades físicas y químicas como,
por ejemplo, amplios espectros de absorción y estrechas
bandas de emisión que permiten obtener múltiples colo-
res uorescentes, tienen un alto rendimiento cuántico que
les brinda un mayor brillo y fotoestabilidad.
(17)
Cuando los semiconductores no nanoestructurados
() absorben la luz, los electrones de la banda de va-
lencia () pasan a la banda de conducción (); se gene-
ra un hueco con carga positiva en la , por lo tanto, por
interacciones coulómbicas los regresan a la y lo ha
-
cen con la emisión de energía en forma de fotón. La dis-
tancia entre - se denomina banda prohibida (Eg).
(18)
Debido a que los tienen un menor número de átomos
con respecto a los , la distancia entre - y la ener-
gía de Eg aumenta, esto se ve reejado en la emisión de
fotones de mayor energía,
(15)
provocando que los ten-
gan excelentes propiedades ópticas.
Para la preparación de los generalmente se utilizan
elementos de los grupos , , , de la tabla periódica,
por ejemplo: CdS, CdSe, CdTe, InP, InAs.
(17)
En el año 2004 se sintetizaron por primera vez los
puntos cuánticos de carbono () que, con respecto a
los , destacan por sus ventajas como: menor toxicidad,
mayor biocompatibilidad, solubilidad en medios acuosos
y abundancia.
(19)
Por lo tanto, los han sido tomados
en cuenta por los cientícos para el desarrollo de impor-
tantes investigaciones como la detección de la calidad e
inocuidad de los alimentos,
(20,
21)
la administración de fár-
macos,
(19)
desarrollo de biosensores.
(22)
Las fuentes de carbono para la síntesis de son
muy variadas como, por ejemplo: ácido cítrico,
(10,
11)
cás-
cara de naranja,
(23)
cáscara de sandía,
(24)
jugo de naranja,
(25)
café,
(26)
tapioca
(27)
y una diversidad de residuos orgáni-
cos provenientes de los desperdicios de los alimentos.
(28)
SÍNTESIS DE PUNTOS CUÁNTICOS DE CARBONO
En el año 2004, se realizaba una síntesis de nanotubos
de carbono, a través del método de descarga de arco; los
investigadores notaron un subproducto uorescente de
diferentes colores. A estas partículas las denominaron
«carbono uorescente» ya que se trataba de material car-
bonoso a escala nanométrica y concluyeron que eran pe-
queños fragmentos de los nanotubos de carbono.
(29)
Desde entonces los investigadores se han enfocado en
el diseño de rutas sintéticas para los ; utilizando dos
enfoques: de arriba hacia abajo (top-down) y de abajo ha-
cia arriba (bottom-up).
(30)
Los métodos top-down consisten en romper la fuente
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de carbono en fragmentos de tamaño nanométrico;
(21)
y
son: descarga de arco, ablación láser, nanolitografía por
grabado de iones reactivos, oxidación electroquímica,
exfoliación química, oxidación ácida. Estos métodos son
costosos ya que requieren de equipos sosticados y una
gran cantidad de energía.
(31)
Por el contrario, los métodos bottom-up consisten en
tres pasos; en primer lugar, se dan reacciones de con-
densación, seguido de agregaciones por fuerzas de inte-
racción, y nalmente, los polímeros se carbonizan para
generar los .
(32)
Son de bajo costo y amigables con el
medio ambiente como: hidrotermal, solvotermal, asisti-
do por microondas, asistido por sonicación.
(30)
PUNTOS CUÁNTICOS DE CARBONO PARA LA CUANTIFI
CACIÓN DE HISTAMINAS
En la tabla 1, se resumen las investigaciones que han uti-
lizado los para cuanticar las ; en donde se puede
observar; la fuente de carbono y métodos para sintetizar
los , su respectiva caracterización como: tamaño de
partícula, potencial z y rendimiento cuántico; además de
una explicación del porqué los pueden cuanticar
las con su respectivo límite de detección () y límite
de cuanticación ().
Anteriormente, se mencionaron las innumerables fuen-
tes de carbono y varios métodos de síntesis de los .
Sin embargo, en los buscadores Science Direct, Wiley,
Publication, Pubmed, Royal Society of Chemistry, Sprin-
gerLink, Igenta Connect, Plos One, Dovepress, Taylor y
Francis solamente se han encontrado cuatro investigacio-
nes que han utilizado los para cuanticar , y sus
años de publicación son entre 2017 y 2020. Por lo tanto,
la industria alimenticia tiene varias posibilidades para se-
guir innovando en este campo de investigación, como la
propuesta planteada en esta revisión bibliográca.
Se ha demostrado que las demás aminas biogénicas y
sus aminoácidos precursores (tiranina, triptanina, histidi-
na) no generan interferencias en la cuanticación de ;
es decir, existe especicidad del método analítico. Esto
se debe a que los elaborados con citrato de sodio y
tiosulfato de sodio; en presencia de , tienen la mayor
constante (Ksv) en el diagrama Stern-Volmer con respec-
to a las sustancias antes mencionadas.
(12)
Por lo tanto, las demás aminas biogénicas, producto
de la contaminación bacteriana y mala conservación de
los mariscos, posiblemente no generarían interferencias
en la cuanticación directa de en el empaque. Sin em-
bargo, la propuesta podría tener dicultades, porque gran
parte de la se concentra en el músculo del marisco y
es necesario realizar su extracción; proceso que se realiza
en la cuanticación de por .
(33)
PUNTOS DE CARBONO CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
En la tabla 2 se pueden observar las investigaciones publi-
cadas en el periodo 2016-2020; que han utilizado los cqd
para inactivar bacterias. Se han seleccionado solamen-
te las bacterias que pueden contaminar a los mariscos y
son productoras de histamina (bph). Las investigaciones
se han enfocado principalmente a la inactivación de Es-
cherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneu-
moniae; no se han encontrado inactivación de otras bph
como Acromonas hydrophila, Hafnia alvei, Proteus morga-
nii, Serratia spp. y Vibrio alginolyticus. Por lo tanto, se ha
demostrado que los cqd tienen el potencial de inactivar
tres bph y existe un antecedente signicativo para el desa-
rrollo de futuras investigaciones enfocadas con la temática
propuesta en este artículo de investigación.
La actividad antibacterial de los se debe a que
Figura 1. Aminas biogénicas
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sus grupos funcionales (amino, carboxilo, hidroxilo, sul-
hidrilo) generan fuerzas electrostáticas con los com-
ponentes de la membrana celular (fosfolípidos, porinas,
peptidoglicanos, etc), provocando su desestabilización y
pérdida de sustancias intracelulares.
(34, 14)
Además, los
se pueden difundir al interior de la célula y formar enla-
ces no covalentes con el provocando el desenrolla-
miento de la doble hélice (ver Tabla 1).
(35)
Los al estar en la escala nanométrica tienen una
alta relación supercie/volumen; que les permite tener
una mayor área de contacto con la membrana celular.
(15)
Esta propiedad potencializa la actividad antibacte-
rial; por ejemplo, se determinó que la concentración
mínima inhibitoria () de la espermidina es >10 mg/
mL, mientras que la para los de espermidina
2-4 ug/mL.
(36)
La actividad antibacterial puede aumentar con el do-
paje de los ; es decir, la modicación de los grupos
funcionales de los con uno o varios heteroátomos.
(34)
Por ejemplo, se determinó que la de los do-
pados con nitrógeno y zinc para Escherichia coli es 1 mg/
ml; pero cuando se utilizó una solución de , sin el do-
paje de zinc y a la misma concentración, no se observó la
inhibición del crecimiento bacteriano.
(37)
Otro de los factores que pueden potencializar la ac-
tividad antibacterial, es la irradiación con luz visible a
los , por ejemplo: los -ZnO (óxido de zinc re-
cubierto con ) a una concentración de 0,1 mg/mL
y en la oscuridad eliminan el 31,59% de Escherichia
coli; mientras que al irradiarlos con luz visible el por-
centaje de eliminación es del 96,94%; esto se debe a la
formación de especies reactivas de oxígeno que tienen
actividad antibacterial.
(38)
De igual manera, se ha demostrado que la actividad
antibacterial no se ve afectada al adherir los a matri-
ces poliméricas; por ejemplo, los en una matriz de
polidimetilsiloxano, produce 5 reducciones logarítmicas
Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae al ser irradiados
con luz visible (λ= 470 nm) por 15 minutos.
(39)
Recientemente se ha demostrado que los a una
concentración del 12% y 48 horas de incubación re-
ducen el 90,73% de histamina; 95,82% de cadaverina;
88,52% de tiranina; 42,09% de putrescina; producidas
por Escherichia coli. El mecanismo de eliminación no
está lo suficientemente claro debido a que los espec-
tros infrarrojos de - son los mismos a , por
lo tanto, se plantearon dos hipótesis: 1) la degradación
de por acción de los , 2) los se adhieren a
las , a través de sus grupos funcionales, lo que hace
imposible su detección.
(40)
Considerando que los tienen la capacidad de in-
activar tres bacterias productoras de histaminas, su acti-
vidad antibacterial se potencializa con la irradiación de
luz visible, la actividad antibacterial no se ve afectada al
adherir los a matrices poliméricas y los pueden
degradar las aminas biogénicas; en este artículo de revi-
sión se ha demostrado que los son una excelente al-
ternativa para el desarrollo de empaques de alimentos del
sector pesquero, con la posibilidad de aumentar la vida
útil de los productos y proporcionar a los consumidores
alimentos inocuos (ver Tabla 2).
empaques funcionalizados con puntos
cuánticos de carbono
Los funcionalizados en empaques mejoran las pro-
piedades mecánicas, por ejemplo, la adición de y
antocianinas a una membrana de almidón, mejoró sig-
nicativamente en la tracción y elongación de rotura. La
funcionalización es posible por la formación de puentes
de hidrógeno de los y los grupos - del almidón
termoplástico.
(58)
Además, el empaque tiene un indica-
dor visual debido a que las antocianinas cambian de co-
lor a diferentes pH, lo que permitió detectar las aminas
biogénicas de la carne de cerdo en descomposición.
(59)
SINOPSIS/PERSPECTIVA/PUNTO DE VISTA
Considerando que la intensidad de la uorescencia de los
puntos cuánticos de carbono (), se modica en pre-
sencia de histamina (); en el presente artículo de revi-
sión se analizó la viabilidad para desarrollar un empaque
para mariscos funcionalizado con , que permita la
cuanticación directa de . La propuesta es innovado-
ra ya que los mejoran las propiedades mecánicas de
los empaques, pero la cuanticación de podría com-
plicarse, debido a que parte de la se concentra en el
músculo del marisco. Sin embargo, se podría aprovechar
las propiedades antibacteriales de los para eliminar
las bacterias productoras de y garantizar un produc-
to inocuo a los consumidores.
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Tabla 1. Cuanticación de con
Fuente de carbono Método de
síntesis
Tamaño de
partícula (nm)
Potencial Z
(mV)
Rendimiento
cuántico (%)
Límite de detección
() y cuanticación
()
Fenómeno de identicación Referencia
Ácido cítrico, N-ace-
til-L-cisteína
(Recubrimiento de Au)
Hidrotermal
200°C por 3 h
3,3
a
197,7 ± 56,2
b
-37,75
a
- 31,66
b
- LD
a
= 21,15 ppb
LD
b
= 13 ppb
La uorescencia se apagó con el
péptido hisp3 por la posible for-
mación de puentes de hidróge-
no y se recuperó con la adición
de .
10
Ácido cítrico, glutation
(Dopaje de Fe
3+
)
Hidrotermal
200°C por 5
min
28,4
c
- 38,2 ± 2,4
c
+ 27,6 ± 0.8
d
54,6%
c
14,1
d
LC
d
= 4,3x10
-7
M
La contiene grupos amino
que pueden coordinarse con el
catión, provocando el apagado
de la luminiscencia.
11
Citrato de sodio, tiosulfa
-
to de sodio
Hidrotermal
200°C por 6 h
~ 5 - 38,7%
e
LD
e
= 5.3 ppm
La tiene mayor Ksv en el dia-
grama Stern-Volmer, con respec-
to a otras aminas biogénicas, lo
que demuestra la fuerte anidad.
12
obtenidos de Beijing
Beida Jubang Science and
Technology Co. Ltd.
- 2-5 - - LD
f
= 70pM
La fue extraída por un nano-
composito de Fe
3
O
4
@Au. La
fue atrapada por los antihistamí-
nicos y existe un apagado de la
uorescencia.
13
a sin recubrimiento de Au
b con recubrimiento de Au
c sin dopaje con Fe3+
d con dopaje con Fe3+
e cqd funcionalizados en una matriz orgánica de 1,3,5-triformiloroglucinol y 2,5-dimetil- p- fenilendiamina, y estabilizados con líquido iónico [VBIm][BF4]
f se creó una membrana nanoporosa de alúmina funcionalizada con (3-glicidiloxipropil) trimetoxisilano (gpms) e inmovilizada con cqd con antihistamínicos.
10
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Tabla 2. Actividad antibacterial de los
Fuente de carbono Método de síntesis Tamaño de
partícula (nm)
Potencial Z
(mV)
Rendimiento
cuántico (%)
Concentración
mínima inhibitoria
Bacterias Referencia
Vitamina C Electroquímico 1,03-1,11 30 25 ug/mL Escherichia coli
35
Ácido cítrico, tris (hidroximetil) aminometano,
Poli(tetrauoroetileno), acetato de zinc
Hidrotermal
200°C por 4 h 1,5-5
b
-
45,6
a
50,8
b
1 mg/mL
b
E. coli
37
Tetrahidrocloruro de espermidina Pirólisis
270°C por 3 h
6,33 ± 1,35 45 3,85 2-4 ug/mL E. coli , P. aeruginosa
36
Extracto de aloe-vera Pirólisis
190°C por 20 min
~ 6-8 - 12,3 - E. coli
41
Hojas de Henna (Lawsonia inermis) Hidrotermal
180°C por 12 h
5 - 28,7 1 mg/mL E. coli
42
Tamarindo Hidrotermal
180°C por 8 h
1-3 4 5 mg/mL Klebsiella pneumoniea
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
43
44
Ácido cítrico, histamina Microondas
130°C, 20 min
300 W
4,6 0-2 - 6,9 ug/mL Escherichia coli
45
13,8 ug/mL Klebsiella pneumoniae
Ácido cítrico, cadaverina 3 9,7 ug/mL Escherichia coli
19,4 ug/mL Klebsiella pneumoniae
Polivinilpirrolidona Hidrotermal
200°C por 6 h
6,5 -6,47 ± 0,67 6 32 ug/mL Escherichia coli
46
Poli (sodio-4-estireno sulfonato) 5 -47,18 9,5
Cáscara de naranja, ácido cítrico Hidrotermal
200°C por 6 h
2,9 ± 0,5 - - -
c
Pseudomonas aeruginosa
47
-
d
Escherichia coli
Aminoguanidina, ácido cítrico Hidrotermal
150°C por 2 h
4,3 ± 0,5 - 3 0,5 mg/mL P. aeruginosa PAO 1 A
48
1 mg/mL P. aeruginosa PAO 1 B
> 1 mg/mL E. coli K12
E. coli DIHO B
2,2 ‘- (etilendioxi) -bis (etilamina); ácido málico Hidrotermal
150°C por 2 h
2-7 -
∼25
- Escherichia coli
49
obtenidos de ( Research Nanomaterials, Inc.);
2,2 ‘- (etilendioxi) -bis (etilamina)
Oxidación con ácido
nítrico
Hidrotermal
120 por 3 días
- - - 64 ug/mL Escherichia coli
50
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Uso de la nanotecnología para el desarrollo de empaques alimenticios del sector pesquero
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Polietilenglicol 400
(Dopado con Ga)
Ultrasonido
70% amplitud, 70,
2 h
6
e
7± 2
f
-20,3
e
16,7-29,2
f
∼1
e
∼2
f
57,5 ppm
e
0,34 ppm
f
P. aeruginosa PAO1
51
52
> 57,5 ppm
e
1,36 ppm
f
P. aeruginosa PA14
P. aeruginosa C3719
Polivinilpirrolidona, dihidroxiacetofenona, nitrato de
plata
Carbonización con
H
2
SO
4
(36N)
14,1
g
114,5
h
- - 0,1 mg/mL
i
Escherichia coli
53
Óxido de zinc, grato
Electroquímico, 15-
60V, corriente conti-
nua, 120 h
Nanovarillas con
un espaciado de
0,3277
- - 0,1 mg/mL
j
Escherichia coli
38
Óxido de titanio, grato 37,62 - - 1 ug/mL
k
Escherichia coli
54
Ampicilina recubierta con CQD (ácido cítrico, etilen-
dianina)
Hidrotermal
250°C por 5 h
3,2 ± 0,8
l
44 ± 10
m
- 32
l
19
m
25 ug/mL
n
14 ug/mL
m
E. coli K12 - MG 1655
55
CQD obtenidos de (US Research Nanomaterials, Inc.);
2,2 ‘- (etilendioxi) -bis (etilamina); azul de metileno
Oxidación con ácido
nítrico
Hidrotermal
120°C por 3 días
- - -
5ug/mL CQD + 1ug/
mL de azul de meti-
leno
o
Escherichia coli
56
polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno
Oxidación con ácido
fosfórico
250°C por 2 h
20 - - 0,94 mg/mL
p
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
39
57
a sin dopaje de Zn
2+
b con dopaje de Zn
2+
c zona de inhibición de 31 mm
d zona de inhibición de 19 mm
e sin dopaje de Ga
3+
f con dopaje de Ga
3+
g sin dopaje de Ag
+
h con dopaje de Ag
+
i los con dopaje de Ag
+
eliminan el 80%-90% de bacterias
j en oscuridad eliminan 31,59% de bacterias y al irradiar con luz visible se elimina 96,94% de bacterias
k al irradiar con luz visible se elimina 90,9% de bacterias
l
m ampicilina recubierta con
n ampicilina libre
o reduce 6,2 log de células viables
p. en una matriz de polidimetilsiloxano; al ser irradiados con luz (λ= 470 nm) por 15 minutos, provoca 5 reducciones logarítmicas
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Los autores declaran de manera explícita, no tener con-
ictos de intereses que pudieren haber sesgado los resul-
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Validación del método de cuanticación de lignina en biomasa de pino
i- 1390-5562 | e- 2477-9121 | año 2021 | volumen 7 | número 2 | pp. 15-19
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REVISTA QUÍMICA CENTRAL
Validación del método de cuanticación de lignina en biomasa de pino
Validation of the lignin quantication method in pine biomass
Lenin Márquez
a
| Paola Cuji
b
| Carlos Méndez
c
| Diego Flores
d
a
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
b
Instituto de Investigación Geológico y Energético, Ecuador
c
Instituto de Investigación Geológico y Energético, Ecuador
d
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
DOI: https://doi.org/10.29166/quimica.v7i2.3258 ISSN impresa 1390-5562
© 2021 Universidad Central del Ecuador ISSN electrónica 2477- 9121
Creative commons NoComercial 4.0 Internacional fcq.quimica.central@uce.edu.ec
, (), -, . -
Lignin is one of the most abundant compounds in the plant world, focused on being a replacement
for oil in various applications. is research consists of the validation of the method «Determination
of lignin in biomass» based on the NREL/TP-510-42618 methodology of the United States National
Renewable Energy Laboratory, applied to pine biomass. By prior moisture quantication and testing
of extractives in water and ethanol to eliminate interfering materials, lignin was quantied applying
gravimetry and UV-Vis spectroscopy techniques at a wavelength of 240 cm, obtaining the soluble lig-
nin content. and insoluble.From the results of the lignin content, the inuence of the environmental
conditions at each test level is evidenced, however, this inuence did not cause a signicant deviation
when compared with the Horwitz equation. us, concluding that the chosen and established experi-
mentation conditions of the range suggested by the NREL methodology allow a correct performance
of the method applied to pine biomass, allowing it to be replicated in the future in dierent investiga-
tions in the country
La lignina es uno de los compuestos más abundantes en el mundo vegetal enfocada a ser el reempla-
zo del petróleo en diversas aplicaciones. La presente investigación consistió en la validación del método
«Determinación de lignina en biomasa» basada en la metodología NREL/TP-510-42618 del Laboratorio
Nacional de Energías Renovables de Estados Unidos, aplicada a biomasa de pino. Mediante previa cuan-
ticación de humedad y ensayo de extractivos en agua y etanol para la eliminación de los materiales in-
terferentes, la lignina se cuanticó aplicando las técnicas de gravimetría y espectroscopía UV-Vis a una
longitud de onda de 240 cm, obteniendo el contenido de lignina soluble e insoluble. A partir de los resul-
tados del contenido de lignina, se evidenció la inuencia de las condiciones ambientales en cada nivel de
ensayo, sin embargo, esta inuencia no ocasionó una desviación signicativa al compararla con la ecua-
ción de Horwitz. Concluyendo así que las condiciones escogidas y establecidas de experimentación del
rango sugerido por la metodología NREL, permiten un correcto desempeño del método aplicado a bio-
masa de pino, permitiendo ser replicada a futuro en diferentes investigaciones en el país.
introducción
La lignina es un polímero fenólico, amorfo y tridimen-
sional del mundo vegetal, compuesto por anillos aro-
máticos en su estructura, responsable de la unión de las
bras de celulosa, capaz de impedir el ujo de agua a tra-
vés de las capas de la planta, estableciendo una resisten-
cia al ataque de microorganismos (Palacios, 2016).
La lignina corresponde a un material renovable que se
encuentra en la mayor parte de la naturaleza, cambian-
do su composición en función del tipo de planta, ade-
más tiene diferente aplicación si se cuantica la lignina
en el tallo, las hojas o cáscaras del fruto. La lignina en
las hojas sirve como indicador para determinar la nutri-
ción foliar, es decir, para suministrar la cantidad idónea
Recepción: 13/08/2021
Aceptación: 21/12/2021
Lignina, biomasa de pino, NREL/TP-
510-42618, espectroscopía UV-Vis, vali-
dación de método.
Received: 13/08/2021
Accepted: 21/12/2021
Lignin, pine biomass, NREL/TP-510-
42618, UV-Vis spectroscopy, method
validation.
Validación del método de cuanticación de lignina en biomasa de pino
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de nutrientes para el desarrollo y mantenimiento de la
planta, o a su vez, modicar el grado de descomposición,
siendo el eje fundamental para aumentar la productivi-
dad (Eddine, 2006).
Mediante la extracción de la lignina existe una amplia
gama aplicativa: al calentarla a altas temperaturas median-
te un proceso de pirólisis catalizada se transforma en car-
bón activado, útil para el tratamiento de aguas residuales
(Cordero, et al., 2007).
Por su propiedad de cohesión aumenta la adhesión
de la estructura del betún, aumentando la rigidez más de
dos veces superior al de una mezcla convencional (Ren,
et al., 2021). Extraída de biomasa procedente de resi-
duos de café o bagazo de caña de azúcar, y adicionada
en un 0,3% para la elaboración de plasticantes aumen-
ta la resistencia a la compresión del material (Martínez,
et al., 2007).
Además, Akhemedov junto con su equipo de investi-
gación, descubrieron acción antimicrobiana y antitumoral
a través de extractivos y derivados de material lignocelu-
lósico mediante estudios realizados en animales, donde
se demostró en ratones que inhibe el crecimiento de sar-
comas y la promoción de tumores cancerígenos en la piel
(Cruz, et al., 1997).
El objetivo esencial de esta investigación es, además
de vericar que el método /-- es adecua-
do para la cuanticación de lignina en biomasa de pino,
transmitir e informar la importancia de este compuesto
que se encuentra presente en la naturaleza, teniendo un
alto potencial en la industria química. Si bien hoy por hoy,
puede que no reemplace en ciertas aplicaciones al petró-
leo en relación costo-benecio, es una realidad que el pe-
tróleo con el paso del tiempo dejará de existir, momento
en el cual la lignina llegará a convertirse en uno de los
biopolímeros motores del mundo.
parte experimental
DISEÑO EXPERIMENTAL
Fundamentado en la optimización de recursos y tiem-
po, el diseño experimental se estructuró para que cada
ensayo de cuanticación de lignina total, denido me-
diante el modelo de la gura 1, se realice 3 veces (ver
Figura 1).
Previamente a la cuanticación de lignina, debe de-
terminarse la humedad antes y después del ensayo de ex-
tractivos, procedimiento que sirve para eliminar cualquier
sustancia interferente.
REACTIVOS, SOLVENTES Y EQUIPOS
Para el desarrollo experimental se empleó la norma /
-510-42618 Determinación de lignina en biomasa,
siendo un proceso sistemático que debe llevarse a cabo
con procedimientos simultáneos como son: /-510-
42621- Determinación de humedad en la muestra, /
-510-42619-Determinación de extractivos en biomasa.
Se utilizó material de referencia de pino del , agua
de grado , alcohol etílico y ácido sulfúrico concen
-
trado grado reactivo; los equipos empleados fueron: ba
-
lanza analítica, horno de secado, rotavapor, bomba de
vacío, mua, espectrofotómetro -Vis, equipo de ex-
tracción Soxhlet.
METODOLOGÍA
Determinación de humedad
Se secan los platos de pesaje a 105°C durante 4 horas,
se enfrían en un desecador, registrando el peso hasta
mantenerse constante, se coloca la muestra y se realiza el
mismo procedimiento.
Determinación de extractivos
Se secan los matraces con núcleos de ebullición a 105°C
durante 8 horas, se enfrían en un desecador, registrando
el peso hasta mantenerse constante. Se instala el equipo
de extracción Soxhlet, previamente vertido 190 mL de
agua en el matraz y colocando la muestra en un dedal de
extracción, se ajusta la manta calefactora para proporcio-
nar un mínimo de 4-5 ciclos de sifón por hora, una vez
terminado el proceso, se lleva al rotavapor para eliminar
el solvente y después se seca el matraz en el horno a 40°C
durante 24 horas, a continuación, se enfría en un deseca-
dor. La muestra en el dedal se introduce nuevamente en
el equipo Soxhlet, previamente vertido 190 mL de alco-
hol etílico en un nuevo matraz, se realiza el mismo pro-
cedimiento, pero esta vez ajustando la manta calefactora
a un mínimo de 6-10 ciclos de sifón por hora.
Determinación de lignina total
Se colocan los crisoles de ltración sin muestra en un
horno mua a 575°C por un mínimo de cuatro horas, se
enfrían en un desecador, registrando el peso hasta man-
tenerse constante. Se toma la muestra seca en un tubo de
presión y se adicionan 3 mL de ácido sulfúrico al 72%,
agitando cada 5 minutos a baño María a 35°C durante
60 minutos.
Una vez terminado se agrega 84 mL de agua y se introdu-
ce en el autoclave durante 30 minutos a 120°C. Cuando
se enfríen los tubos se procede a ltrar la suspensión. Los
crisoles de ltración se secan a 105°C durante 4 horas,
enfriando en un desecador hasta peso constante.
Mientras tanto, el líquido se diluye hasta alcanzar una
absorbancia entre 0,7-1,0 y se analiza por espectrofoto-
metría uv-Vis a una longitud de onda de 240 nm, toman-
do como referencia un blanco con agua.
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Figura 1. Aminas biogénicas
Figura 2. Resultados del porcentaje de lignina insoluble
Tabla 1. Resultados de los ensayos de humedad
% humedad 3,8356 3,8356 3,6072
3,9043 3,9043 3,5575
Promedio 3,8700 3,8700 3,8700
Tabla 2. Resultados de los ensayos de extractivos
% extractivos en agua 4,5217 3,5152 4,0913
% extractivos en alcohol 1,0200 1,2508 1,4377
% extractivos total 5,5417 4,7660 5,5289
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Figura 3. Resultados del porcentaje de lignina soluble
Figura 4. Resultados del porcentaje de lignina total
resultados y discusión
RESULTADOS DE HUMEDAD
El ensayo de humedad representa el contenido de agua
presente en la muestra (ver Tabla 1).
RESULTADOS DE EXTRACTIVOS
El ensayo de extractivos determina la presencia de sus-
tancias solubles o anes al alcohol y al agua, que intere-
ren en el resultado como pueden ser: azúcares no estruc-
turales, material nitrogenado e inorgánico (ver Tabla 2).
RESULTADOS DE LIGNINA INSOLUBLE
La gura 2 indica el contenido de lignina insoluble determi-
nada a partir de 4 repeticiones en cada ensayo (ver Figura 2).
RESULTADOS DE LIGNINA SOLUBLE
La gura 3 representa el contenido de la lignina soluble
determinada mediante 3 réplicas en cada repetición a
una longitud de onda de 240 nm (ver Figura 3).
RESULTADOS DE LIGNINA TOTAL
La gura 4 presenta la cantidad de lignina total equivalen-
te a la suma de la lignina soluble e insoluble (ver Figura 4).
TRATAMIENTO ESTADÍSTICO
La estadística reeja la credibilidad o, a su vez, la manera
en que se pueden interpretar los resultados de la investi-
gación, por consiguiente, a continuación, se maniestan
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las características de desempeño del método.
Repetibilidad
El coeciente de variación de repetibilidad reeja la dis-
persión de los datos de los ensayos realizados bajo las
mismas condiciones.
Reproducibilidad
El coeciente de variación de reproducibilidad reeja la
dispersión de los datos de los ensayos realizados bajo di-
ferentes condiciones.
Veracidad
La veracidad del método determina la exactitud, al com-
parar un valor referencial y el valor obtenido de mane-
ra experimental.
El método se desarrolló utilizando reactivos de alta pu
-
reza, pudiendo la variabilidad de las características de
desempeño verse afectadas si se utilizara otro tipo de re-
activos, en este sentido, es de suma importancia conti-
nuar con investigaciones aplicadas a diferentes materias
primas, al mismo tiempo que permitan la optimización
del proceso, llegando a ser de gran utilidad en un futu-
ro para el desarrollo de productos con mayor valor agre-
gado y de economía circular sostenible en nuestro país.
Las grácas del contenido de lignina nos permiten
apreciar la variabilidad en los ensayos, manifestando dis-
persión en los valores inuenciados por las condiciones
ambientales, pudiendo ser considerados en el resultado
nal como fuente de incertidumbre de error tipo A.
conclusiones
A partir de los resultados de las ecuaciones 1 y 2 corres-
pondientes a 0,57% y 1,90%, se concluye que el método
demuestra tener repetibilidad y reproducibilidad, debido
a que estos valores no sobrepasan los objetivos 1,21% y
2,42% calculados mediante la ecuación de Horwitz, es
decir, que los datos aseguran la precisión del método.
En vista de que el valor de veracidad equivalente a
100,18%, no sobrepasa el límite establecido de 98%-
102%, se concluye que el método garantiza resultados
con valores exactos.
El desarrollo del método establece que las condicio-
nes experimentales establecidas reejan un buen desem-
peño para la cuanticación del contenido de lignina en
biomasa de pino.
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Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis de población en riesgo
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REVISTA QUÍMICA CENTRAL
Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacari-
dosis de población en riesgo
Biochemical tests for screening and timely diagnosis of Mucopolysaccharidosis for population
at risk
Walkyrie Aguilar (†)
a
| Guadalupe Jibaja
b
| Lourdes Pazmiño
c
a
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
b
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
c
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
DOI: https://doi.org/10.29166/quimica.v7i2.3304 ISSN impresa 1390-5562
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, (), -, . -
Mucopolysaccharidosis are rare, low prevalence diseases and are of lysosomal deposit. ey are produced
by the accumulation of dierent types of glycosaminoglycans due to the genetic defect that produces the
absence of the respective enzymes for their degradation. We propose biochemical tests for the screening
and timely diagnosis of mucopolysaccharidosis for the ecuadoran population at risk. Spectrophotometry
with dimethyl methylene blue reagent was used to determine concentrations of glycosaminoglycans in uri-
ne samples, from patients with mucopolysaccharidosis diagnosis and healthy patients. Agarose gel electro-
phoresis was used to classify the type of mucopolysaccharidosis. In the present investigation we determined
the concentration of glycosaminoglycans in urine samples, with a statistically signicant dierence between
healthy patients and patients with a diagnosis of MPS. However, the electrophoresis technique did not allow
classifying the various types of mucopolysaccharidosis. e concentrations of glycosaminoglycans in pa-
tients with mucopolysaccharidosis are higher than those of healthy patients, therefore the technique is valid
for the determination of glycosaminoglycans. Spectrophotometry with dimethyl methylene blue is suitable
for the screening and diagnosis of mucopolysaccharidosis. e methodology used for the correct classi-
cation of the type of mucopolysaccharidosis, by electrophoresis in agarose, did not give conclusive results.
Las mucopolisacaridosis son enfermedades raras, de baja prevalencia y de depósito lisosomal. Se produ-
cen por la acumulación de diferentes tipos de glucosoaminoglicanos debido al defecto genético que pro-
duce la ausencia de la enzima respectiva para su degradación. En el presente trabajo se proponen pruebas
bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis para población ecuatoria-
na en riesgo. Se utilizó el método espectrofotométrico con azul de dimetil metileno para determinar las
concentraciones de diferentes glucosaminoglicanos en muestras de orina de pacientes diagnosticados
con mucopolisacaridosis y pacientes sanos. Se realizó la electroforesis en gel de agarosa para clasicar el
tipo de mucopolisacaridosis. Se obtuvo la concentración de glucosaminoglicanos en muestras de orina,
con una diferencia estadísticamente signicativa entre pacientes con diagnóstico de mucopolisacarido-
sis y pacientes aparentemente sanos. Sin embargo, la técnica de electroforesis no permitió clasicar los
diversos tipos de mucopolisaridosis. Las concentraciones de glucosaminoglicanos de pacientes con mu-
copolisicaridosis son más elevadas que las de pacientes aparentemente sanos por lo que la técnica es vá-
lida para la determinación de glucosaminoglicanos por el método espectrofotométrico de azul de dimetil
metileno, y sirve para realizar el tamizaje y diagnóstico de mucopolisacaridosis. La clasicación del tipo
de mucopolisacaridosis por electroforesis en agarosa, no brindó resultados concluyentes.
introducción
Las , enfermedades de depósito lisosomal, son erro-
res innatos del metabolismo () debido a los que
se acumulan por el décit de por lo menos una de las 11
enzimas que degradan a estos polisacáridos sulfurados.
Los son polímeros lineales formados por unidades
repetidas como son los disacáridos, de carácter ácido.
Generan la matriz extracelular, formando moléculas de
mayor complejidad como los proteoglicanos (Lin et al.,
2019; Stapleton et al., 2018; Kobayashi, 2019; Kubaski
et al., 2020a, Wilson et al., 2018). Estos compuestos son
degradados por enzimas especícas que, en caso de pre-
sentarse en menor concentración, producen una acumu-
Recepción: 31/08/2021
Aceptación: 15/12/2021
Mucopolisacaridosis, MPS, glicosami-
noglicanos, GAG, tamizaje, diagnóstico.
Received: 13/08/2021
Accepted: 21/12/2021
Mucopolysaccharidosis, MPS, glyco-
saminoglycans, GAG, screening, diag-
nosis.
Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis de población en riesgo
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lación a nivel de los lisosomas, y cuya concentración en
exceso es excretada por la orina. Las son enferme-
dades genéticas (González Andrade et al., 2017) que se
transmiten como enfermedades autosómicas recesivas y
ligadas al cromosoma X, como el síndrome de Hunter.
La acumulación sistemática de , como del heparán
sulfato, dermatán sulfato, condroitín sulfato, y/o quera-
tán sulfato se asocia con síndromes clínicos especícos
(Poswar et al., 2019).
Las formas más sencillas se caracte-
rizan por anormalidades de los huesos y enanismo, dete-
rioro progresivo cardiopulmonar y muerte en el período
de la infancia o adulto joven. Las formas más progresivas
pueden desarrollar retardo mental y se presentan con
un retardo en el desarrollo, facies especícas y anorma-
lidades de los huesos (Kubaski et al., 2020b). Por otro
lado, las funciones auditivas, visuales y cardiovasculares,
como la movilidad articular pueden estar comprometi-
das (Kobayashi, 2019).
El retardo mental es característico
de la tipos , y . El manejo de soporte y paliativo
para las complicaciones respiratorias y cardiovasculares,
como auditivas e hidrocefalia, pueden mejorar notable-
mente la calidad de vida de estos pacientes y sus familias.
Las aparecen, en la mayoría de los casos, du-
rante la infancia sin síntomas clínicos evidentes al
momento del nacimiento. Los pacientes con de-
muestran un rango amplio de síntomas multistémi-
cos con un curso crónico y progresivo, debilitando
al sistema óseo y cardiopulmorar, cornea, piel, híga-
do, cerebro y meninges (Gomes Bicalho et al., 2011).
Los tratamientos han demostrado que son
más efectivos cuando más temprano se realice el
diagnóstico. Existen varias alternativas terapéuticas
para tratar las , como el reemplazo enzimático,
trasplante de médula ósea, trasplante de sangre de
cordón umbilical, terapia y edición génica (Kubas-
ki et al., 2020a).
Los se determinan por varios
métodos (Lin et al., 2019; Colón et al., 2017; Kubas-
ki et al., 2020b).
Los pacientes de la población ecuatoriana diag-
nosticados con lo han sido en laboratorios de
fuera del país, como es el caso de pacientes de la Fun-
dación Fepel Dasha. En los laboratorios de diag-
nóstico del Ecuador no se han comprobado estas
pruebas, por tanto, se limita el acceso al diagnóstico
a todos aquellos pacientes que presentan mayor ries-
go de desarrollar estas enfermedades genéticas .
El laboratorio de Docencia de Análisis Clínicos de
la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
Central del Ecuador (), cuenta con los equipos
y los profesionales (bioquímicos clínicos) para rea
-
lizar y validar las pruebas para diagnosticar las .
El objetivo es proponer pruebas bioquímicas
para el diagnóstico oportuno de desde el la-
boratorio clínico de la Facultad de Ciencias Quí-
micas, .
parte experimental
MATERIALES Y REACTIVOS
Los equipos utilizados fueron: equipo de espectrofo-
tometría Fisher Scientic SP-2100UVPC y equipo de
electroforesis horizontal biostep gelco GH200 series;
además de los reactivos 1,9-Dimethyl-Methylene Blue
Zinc Chloride Double Salt Dye Content grado p.a. pure-
za > 80% (1 g); etanol grado p.a. pureza 96% (1 L); acido
fórmico (100 mL); formiato de sodio (250 g); condroi-
tin sulfato (500 mg), dermatán sulfato (25 mg); hepa-
rán sulfato proteoglicano (1 mg); gel de agarosa (100 g);
tampón (10X) (1 L) (Tris base, 48,4 g; ácido acético
glacial, 11,4 mL; 0,5 M EDTA pH 8; 20 mL); tampón de
carga (40% Sacarosa, 4 g; 3% glicerol, 3 mL; 0,025% azul
bromofenol, 25 mg); agua destilada; azul de Coomassie
(0,25g); metanol grado p.a. pureza 96% (90 mL) y ácido
acético glacial (10 mL).
MÉTODOS
Se realizó la validación de las pruebas de bioquímicas
de en espectrofotometría con el reactivo . El
método utilizado se basó en una patente (Sampedro et
al., 2015).
Se desarrolló la validación de las pruebas de ta-
mizaje y diagnóstico de laboratorio clínico al de-
terminar la concentración de en muestras de
pacientes que presentan los diferentes tipos de ,
y que pertenecen a la fundación Fepel Dasha y con
pacientes aparentemente sanos, estudiantes de la
(grupo control) que se atendieron en el laboratorio
clínico de la Facultad Ciencias Químicas, . Otros
colaboradores fueron, el laboratorio docente de Aná-
lisis Clínico y Fundación Fepel Dasha y sus pacien
-
tes con diagnóstico de . Para el grupo de estudio,
el criterio de inclusión fue el diagnóstico previo de
(realizado en laboratorios extranjeros ya que en
nuestro país no se realiza esta prueba) mientras que
para el grupo control el criterio de inclusión fue ser
estudiantes aparentemente de la que acudieron
al servicio de laboratorio clínico.
El objetivo de la presente investigación no fue
diagnosticar a los pacientes, sino utilizar las mues-
tras de los pacientes diagnosticados con algún tipo
de (se utilizó muestreo no probabilístico por
conveniencia, pacientes de la Fundación Fepel Das-
ha diagnosticados con un tipo de , muestra dis-
ponible en el periodo de tiempo de la investigación).
No fue necesario realizar un emparejamiento y ce-
gamiento de los pacientes que intervinieron en la inves-
tigación ya que ésta no fue un estudio epidemiológico.
Se aplicó consentimiento informado, documento r-
mado por el paciente o su representante. El representante
Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis de población en riesgo
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del paciente rmó la declaración de condencialidad co-
nociendo que toda información de los pacientes será ma-
nejada con absoluta confidencialidad por parte de los
investigadores, y que los datos de liación serán utilizados
exclusivamente para garantizar la veracidad de los mismos.
Determinación de concentración de en orina, por el
método espectrofotométrico con
Con ayuda del analizador Fisher Scientic SP-
2100UVPC, localizado en el Laboratorio de Análisis
Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas de la Uni-
versidad Central del Ecuador, se prepararon soluciones
acuosas de concentraciones de de 10, 25, 50 y 100
g/mL de condroitin sulfato, dermatán sulfato y heparán
sulfato de la casa comercial Sigma Aldrich, midiendo su
absorbancia con la disolución de azul de dimetilmetileno
(), de 0,35 mmol/L disuelto en etanol y en tampón
formiato de sodio. Posterior a ello, se procedió a leer la
absorbancia del complejo - de cada estándar y
las muestras de orina de pacientes con de diferentes
tipos, a condiciones óptimas de pH 4, longitud de onda
528 nm, tiempo de reacción 5 minutos, y temperatura
ambiente en un rango de 20-25ºC. El rectivo es ca-
paz de unirse especícamente a los sulfatados debi-
do a la carga negativa de éstos. Se calcula por medio de
la ley de Beer la concentración de comparando con
la concentración de los estándares (Aranzadi et al., 2002;
Cueva, 2019).
Procedimiento con prueba de azul de dimetilmetileno
() por electroforesis en gel de agarosa.
Para la clasicación del tipo de , se preparó el gel de
agarosa. Pesar 0,4 g de agarosa, cantidad necesaria para
obtener la concentración deseada 0,8% en función del
volumen de gel aproximadamente de 10 x 10 cm ajustan-
do a 50 mL con el buer para la electroforesis. Se calentó
la mezcla en un horno de microondas por un minuto,
hasta observar que toda la agarosa se ha fundido. Se
procedió a enfriar la solución de agarosa hasta una tem-
peratura de unos 50°C. Mientras la solución de agarosa
se enfría, se prepara el molde en el que se va a elaborar
el gel, sellando los bordes, colocándolo en el dispositivo
previsto para ello, y colocando el peine en la posición de-
seada. Se vierte cuidadosamente la solución de agarosa
sobre el molde nivelado y se deja que solidique durante
al menos 30 min. Una vez que el gel se solidicó, se pro-
cedió a retirar el sellado de los bordes y colocar el molde
con el gel en la cámara de electroforesis. Luego, se pin-
chó cuidadosamente con el peine para que queden libres
los pocillos para lo cual se depositaron las muestras (la
solución del gel de agarosa presentó un pH cercano a 8,3
sin necesidad de ajustarla).
Preparación del buer de corrida para la electroforesis
Para la solución 10X, se pesó Tris base, 48,4 g; se usó
ácido acético glacial, 11,4 mL; 0,5 M pH 8, 20 mL y
se ajustó a 1 L con agua bidestilada. Se tomó una alícuota
de 50 mL del buer para la electroforesis y se llevó a 1 L
con agua bidestilada hasta tener un 0,5X. Esta solu-
ción se añadió luego en la cámara de electroforesis hasta
que cubra el gel unos 3-5 mm. El se preparó previa-
mente, añadiendo al agua bidestilada (un volumen 20%
inferior al volumen nal deseado) la cantidad de 18,61
g de y se disolvió en 70 mL de agua destilada para
obtener una concentración nal de 0,5 M. Se ajustó el pH
con NaOH hasta obtener una solución pH 8. Se ajustó el
volumen a 100 mL. El se diluyó con agua destilada
antes de cada electroforesis para lograr la concentración
de uso de 0,5X. Se procedió a vericar con un potenció-
metro el pH de la solución amortiguadora, la misma que
tuvo un pH cercano a 8,3 sin necesidad de ajustarla. En la
electroforesis, el amortiguador ejerce dos funciones: por
un lado, lleva la carga eléctrica y, por otro, determina la
carga neta de las moléculas que se separan.
Preparación de las muestras y estándares.
Se precipitó 50 µL de las muestras de orina y con los
diferentes estándares con 1000 µL de por 5 min a
20-25°C, y se procedió a centrifugar a 10.000 g duran-
te 10 minutos, luego se descartó el sobrenadante. Con el
precipitado que quedó, se mezcló 100 µL con un buer
de carga (6X); 0,025% azul de bromofenol, 25 mg; 40%
sacarosa, 4 g; o 3% glicerol, 3 mL y ajustar a 10 mL con
agua destilada. El volumen total estuvo determinado por
el tamaño de los pocillos, habitualmente de 10 µL. (An-
tes de cargar la muestra de orina, previamente agitar. Se
almacenaron los buers bajo refrigeración para evitar el
crecimiento de hongos entre 2 y 8°C.)
Carga de las muestras y estándares en el gel de electroforesis
Se cargaron en los pocillos las muestras que se pre-
pararon. Al momento de sumergir las muestras en la
cámara de electroforesis, se aseguró que los pocillos
del gel estaban totalmente cubiertos por el buer. Se
procedió a conectar los cables a la fuente de alimen-
tación, uno positivo y otro negativo (frecuentemen-
te representados por colores rojo y negro, respecti-
vamente), y se aplicó un voltaje de 80 V con un valor
de corriente aproximado 40 mA durante 1 h 30 mi-
nutos. Se tuvo en cuenta que los migraron hacia
el cátodo, por lo que debe disponerse correctamente
la orientación del gel y de los cables. Se realizó la
electroforesis hasta que el frente de corrida (visuali-
zado como una línea azul por el colorante del buer)
llegó a los límites de la parte inferior a un 25% apro-
ximadamente 40 a 60 minutos de la longitud total
del gel. En ese momento se detuvo la electroforesis.
Finalizada la electroforesis se procedió al desmonta-
je del equipo, se desconectaron los electrodos de la
fuente de poder ya apagada y se removió el sistema
que contiene el gel de agarosa. Se enjuagaron con
agua destilada todos los componentes de electrofo-
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resis al terminar la corrida. Se procedió a reutilizar
el buer de electroforesis hasta 6 veces.
Tinción del gel y visualización
Terminada la electroforesis, se realizó la tinción, y para
ello se sacó el gel de su molde cuidadosamente; se su-
mergió luego en una disolución azul de Coomasie; 0,25
g en 90 mL de metanol (96%): H
2
O (v/v 1:1) y 10 mL
de ácido acético glacial y con suave movimiento rotato-
rio, durante 5 minutos. Se realizó la coloración del gel
por más de dos horas, debido a que el colorante puede
quedar retenido fuertemente en el gel generando un fon-
do oscuro por sobre tinción que impediría la visualiza-
ción de los . Se procedió a ltrar la solución de azul
de Coomasie a través de un papel Whatman .° 1 para
eliminar los residuos extraños; antes de usar se dejó en
reposo por una semana en un frasco oscuro. Culminado
el tiempo de incubación, se depositó el colorante en el
frasco original. Finalizada la tinción, se sumergió en una
disolución preparada de decoloración lenta (10 mL de
ácido acético 10% más 5 mL de metanol más 85 mL agua
destilada), o en una disolución de decoloración rápida
(10 mL de ácido acético 10% más 50 mL de metanol más
40 mL agua destilada), durante 24 a 48 horas. Se lavó el
gel para quitar los residuos que dejó el colorante y no se
jó a las moléculas, luego se lavó con agua destilada para
frenar la decoloración.
Se retiró el colorante con movimiento constante, y se
cambió la solución por una nueva (esto de lo hace cuan-
tas veces sea necesario según el desteñido). Se procedió
a seguir destiñendo hasta que las bandas de los se
apreciaron claramente. El ácido acético puede ser utili-
zado en concentraciones de 5% o 10%. Los se visua-
lizaron como bandas y se compararon con los estándares.
resultados y discusiones
Se evidenció que la disolución de , de la casa comer-
cial de Sigma Aldrich, se debe preparar a una concentra-
ción de 0,35 mmoL/L preferiblemente disuelto en etanol
y en tampón formiato de sodio, para que la absorbancia
aumente conforme se va formando el complejo -
de cada estándar y muestra, teniendo una relación lineal
en función de la Ley de Beer, y al límite de cuanticación
de los estándares, lo que condujo a condiciones óptimas
de pH 4, longitud de onda 528 nm, tiempo de reacción 5
minutos, y temperatura ambiente en un rango de 20-25ºC;
condiciones en las cuales es capaz de unirse especíca-
mente a los sulfatados debido a su carga negativa.
Estos valores fueron comparados y se obtuvieron re-
sultados similares en relación con los indicados por el
autor De La Cruz (De la Cruz Amorós et al., 1999) (ver
Tabla 1).
Los cálculos de los parámetros estadísticos para la de-
terminación de concentración de con los estánda-
res (Tabla 2; Tabla 3) muestran las curvas de calibración,
donde se midió la señal de respuesta por triplicado de
cuatro soluciones con concentraciones espaciadas en
forma independiente (n = 12) a lo largo del intervalo 10,
25, 50 y 100 g/mL para cada . Los resultados fueron
expresados como valores medios y al aplicar la prueba
de hipótesis con de un solo factor, existe diferen-
cias estadísticamente signicativas, con un intervalo de
conanza del 95% (p < 0,05) (dos colas y 3 grados de li-
bertad), por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acep-
ta la hipótesis alternativa, demostrando que sí se puede
obtener la concentración de en muestras de orina,
de esta manera se puede comparar con el rango de refe-
rencia, se encuentran concentraciones superiores o in-
feriores al límite de cuanticación. De igual manera, los
resultados de la gura 1 evidencian un comportamiento
de una manera aproximadamente normal demostrada
con la prueba de normalidad de Kolmolgorov-Smirnov,
Anderson-Darling y Ryan-Joiner, por el modelo de re-
gresión de los mínimos cuadrados, aplicándose un ajuste
lineal de dispersión obtenido en cada una de las curvas,
y estableciéndose con los valores máximos y mínimos
como se distancian respecto de la media con un interva-
lo de conanza del 95% (p < 0,05) en aquellas variables
cuantitativas en las que se realizó dicho ajuste, que en
función de un pH entre 3 y 6 se tiene un mejor com-
portamiento con una clara diferencia de los máximos de
absorbancia en los que presentaban los complejos -
. El autor De la Cruz obtuvo resultados de absor-
bancia máximas en muestras en pH entre 3 y 6. Para la
precisión, los coecientes de variación fueron de 0,61%
para coindroitin sulfato, 0,59% para dermatán sulfato
y 0,97% para heparán sulfato. Los límites de detección
que se obtuvieron fueron de 0,11 g/mL para coindroitin
sulfato, 0,08 g/mL para dermatán sulfato y 0,14 g/mL
para heparán sulfato, comparándose con las concentra-
ciones de las muestras de orina que fueron mayores a los
límites de detección, indicando que el método es válido.
Se puede decir que el intervalo de concentración de las
curvas de calibración fue de 10 y 100 g/mL para cada
. 0,0142 A/g/mL para coindroitin sulfato, 0,0090 A/
g/mL para dermatán sulfato y 0,0158 A/g/mL para he-
parán sulfato, que corresponde a la pendiente de la recta
de calibración, indicando que el método es sensible y se
puede determinar (ver Tabla 2 y Figuras 1, 2, 3 y 4).
En la actualidad los pacientes son diagnosticados en
países extranjeros. Generalmente son atendidos cuan-
do la enfermedad ya ha avanzado en su desarrollo, en la
mayoría de los casos solo se aplican cuidados paliativos,
comprometiendo la salud del paciente, el bienestar y la
economía familiar, pese a que la Ley Orgánica de la Salud
protege y garantiza su diagnóstico y tratamiento
(Gon-
zález Andrade et al., 2017) (ver Tabla 3 y Figuras 5 y 6).
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Tabla 1. Programación del analizador Fisher Scientic -2100 para determinar s
General
Modo de medición Absorbancia
Modo de reacción -
Modo de calibración Regresión lineal
Blanco Azul de dimetilmetileno
Longitud de onda 528 nm
Temperatura 20-25°C
Unidades µg/mL
Análisis
Volumen de muestra 50 µL
Reactivo Azul de dimetilmetileno
Volumen 1000 µL
Tiempo de incubación 5 minutos
Cálculos
Dirección de la reacción Incremento
Cálculo Punto nal
Calibración
Intervalo de calibración Cada corrida
Número de estándares 4
STD1: 10
STD2: 25
STD3: 50
STD4: 100
-: luz de visibilidad ultravioleta, nm: nanómetros, ug: microgramos, ml: mililitros uL: microlitros, : estándar.
Tabla 2. Valores medios de absorbancia reales de las soluciones estándar para el condroitin sulfato y prueba de precisión, límite de detección,
linealidad, sensibilidad y correlación
Solución de chondroitin sulfato (g/mL) Absorbancia
10 0,411
25 0,421
50 0,445
100 0,544
Promedio 0,455
sd 0,003
(%) 0,61
(g/mL) 0,11
Linealidad (g/mL) 10 a 100
Sensibilidad (A/g/mL) 0,0142
Correlación 0,9637 p < 0,018
g: microgramos, mL: mililitros, : desviación estándar. : coeciente de variación, : límite de detección.
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25
0,0300,0150,000-0,015-0,030
99
90
50
10
1
Residuo
Porcentaje
0,550,500,450,40
0,01
0,00
-0,01
Valor ajustado
Residuo
0,0100,0050,000-0,005-0,010-0,015
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
Residuo
Frecuencia
4321
0,01
0,00
-0,01
Orden de observación
Residuo
Gráfica de probabilidad normal vs. ajustes
Histograma vs. orden
Gráficas de residuos para Chondroitin sulfato (μg/mL)
Figura 1. Línea ajustada chondroitin sulfato (g/mL)
Figura 2. Residuos de chondroitin sulfato (g/mL).
Figura 4. Línea de residuos para dermatán sulfato (g/mL).
Figura 3. Línea ajustada para dermatán sulfato (g/mL).
1
00
8
0
6
0
4
0
2
0
0
0,56
0
,54
0
,52
0
,50
0
,48
0
,46
0
,44
0
,42
0
,40
S 0
,0141737
R
-cuad.
9
6,4%
R
-cuad.(ajustado)
9
4,5%
C
hondroitin sulfato (μg/mL)
Absorbancia
G
ráfica de línea ajustada para Chondroitin sulfato (μg/mL)
Y
CS = 0,3854 + 0,001510 XCS
100806
0
4
0
2
0
0
0,44
0
,
4
2
0
,
4
0
0
,
3
8
0
,
3
6
0
,
3
4
0
,
3
2
S 0
,
0
086079
R
-
c
uad.
9
7
,
3%
R-cuad.(ajustado) 95,9%
Dermatán sulfato (μg/mL)
Absorbancia
G
rá
f
ica de línea ajustada para Dermatán sulfato (μg/mL)
YDS = 0,3186 + 0,001069 XDS
0
,
0
2
0
,
0
1
0
,
0
0
-
0
,
0
1
-
0
,
0
2
9
9
90
5
0
1
0
1
Residuo
Porcentaje
0
,
4
2
0
,
4
0
0
,
3
8
0
,
3
6
0
,
3
4
0,010
0
,
0
0
5
0
,
0
0
0
-0,005
-0,010
Valor ajustado
R
esiduo
0
,
0
1
0
0
,
0
0
5
0
,
0
0
0
-
0
,
0
0
5
-
0
,
0
1
0
2
,
0
1
,
5
1
,
0
0
,
5
0
,
0
R
e
s
i
d
u
o
Frecuencia
4321
0,010
0
,
0
0
5
0,000
-
0
,
0
0
5
-
0
,
0
1
0
O
r
d
e
n
d
e
o
b
s
e
r
v
a
c
ió
n
R
esiduo
G
rá
f
i
c
a
d
e
p
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d
n
o
r
m
a
l
v
s
.
a
j
u
s
t
e
s
H
i
s
t
o
g
r
a
m
a
vs. orden
Gráficas de residuos para Dermatán sulfato (μg/mL)
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Tabla 3. Valores de absorbancia reales de las soluciones estándar para el heparán sulfato y prueba de precisión, límite de detección, linealidad,
sensibilidad y correlación
Solución de heparán sulfato (g/mL) Absorbancia
10 0,355
25 0,364
50 0,372
100 0,454
Promedio 0,386
sd 0,004
(%) 0,97
(g/mL) 0,14
Linealidad (g/mL) 10-100
Sensibilidad (A/g/mL) 0,0158
Correlación 0,9198 p < 0,041
g: microgramos, mL: mililitros, A: absorbancia. : desviación estándar, : coeciente de variación, : límite de detección.
100806040200
0,450
0,425
0,400
0,375
0,350
S 0,0157999
R-cuad. 92,0%
R-cuad.(ajustado) 88,0%
Heparán sulfato (μg/mL)
Absorbancia
Gráfica de línea ajustada para Heparán sulfato (μg/mL)
YHS = 0,3349 + 0,001107 XHS
Figura 5. Línea ajustada para heparán sulfato (g/mL)
Figura 6. Línea de residuos para heparán sulfato (g/mL)
0,0300,0150,000-0,015-0,030
99
90
50
10
1
Residuo
Porcentaje
0,4500,4250,4000,3750,350
0,01
0,00
-0,01
-0,02
Valor ajustado
Residuo
0,0100,0050,000-0,005-0,010-0,015-0,020
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Residuo
Frecuencia
4321
0,01
0,00
-0,01
-0,02
Orden de observación
Residuo
Gráfica de probabilidad normal vs. ajustes
Histograma vs. orden
Gráficas de residuos para Heparán sulfato (μg/mL)
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Tabla 4. Frecuencia por grupos de edad/género para cada glucosaminoglicano con la prueba de .
Edad Frecuencia
(n)%
Frecuencia masculina
(n)(%)
Frecuencia femenina
(n)(%)
18-19 97 (41) 25 (28) 72 (49)
20-34 138 (59) 63 (72) 75 (51)
Total 235 (100) 88 (37) 147 (63)
Concentración (g/mL)
Edad condroitin sulfato dermatán sulfato heparán sulfato CV%
18-19 6,53 ± 0,002 8,36 ± 0,002
7,55 ± 0,002 0,74
20-34 6,48 ± 0,002 8,29 ± 0,002
7,50 ± 0,002 0,59
: coeciente de variación. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. : = 7,22, p < 0,001.
Figura 7. Frecuencia de la población estudiada por grupos de edad
y género
Figura 9. Correlaciones entre variables. Concentración de GAGs, edad,
sexo, tratamiento. No existe correlación entre las variables, concentra-
ción de GAGs µg/mL- edad y sexo del paciente
Figura 10. Correlación entre Pacientes (con edad)
Figura 8. Valores de glucosaminoglicanos en muestras de orina con
la prueba de azul de dimetilmetileno según la edad. Mann-Whitney:
p < 0.017.
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Figura 11. Correlación entre pacientes (sin edad)
Figura 12. Correlación ACP con edad
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De acuerdo, a los resultados obtenidos de los exámenes
con muestras de estudiantes de la Universidad Central
del Ecuador con la prueba de azul de dimetilmetileno
() por el procedimiento de espectrofotometría para
la determinación de concentración de , (ver Tabla 4
y Figuras 7, 8, 9), en relación a pruebas bioquímicas con-
vencionales del laboratorio clínico, se observa valores
considerados normales, donde, se realizaron biometría
hemática, glucosa, urea, ácido úrico, colesterol, trigli-
céridos y creatinina, no evidenciándose la presencia de
enfermedades que pueden aumentar la excreción urina-
ria de , cómo tampoco en otros factores fenotípicos
como rasgos faciales toscos, por lo que, no fue necesario
la aplicación de la electroforesis para el tipo de , que-
dando así en procedimientos estandarizados para futu-
ras determinaciones.
De acuerdo con el valor de R (Stapleton et al.,
2018)
éste es signicativo, lo que indica que no afecta la
interpretación de variables signicativas. De esta manera
se comprueba la relación signicativa entre los y la
edad (ver Figuras 10, 11, 12).
El R
(Stapleton et al., 2018) indica que el modelo tiene
un buen ajuste y, al examinar la gráca de línea ajustada y
la gráca de residuos, muestra relación entre de pa-
cientes con y las edades de los pacientes.
Kubaski F. y su equipo de investigación realizaron la
determinación de en orina de pacientes con dife-
rentes tipos de y, de diferentes edades, encontrándo-
se que los valores varían por la edad y el tipo de (ver
Figuras 13.1, 13.2, 14, 15).
Sabir E.
y su equipo de investigación realizaron estu-
dios de concentración de por el método espectro-
fotométrico en orina de pacientes con , además
realizaron investigaciones de estabilidad de las muestras
a diferentes temperaturas, lo que fue tomado en cuenta
para la presente investigación.
Se desarrollaron parámetros de linealidad, sensibili-
dad y correlación. En la determinación de la concentra-
ción de en orina de pacientes aparentemente sanos
que acudieron al laboratorio clínico de la Facultad de
Ciencias Química de la , lo que demuestra que exis-
te linealidad en los datos obtenidos por espectrofotome-
tría con el reactivo . Se cumple con una distribución
homogénea, repetilibilidad en los datos y que se realizó
previamente el análisis de con muestras de pacien-
tes diagnosticados con .
Para realizar el análisis de la concentración de en
muestras de orina de pacientes diagnosticados con
se varió el tiempo de reacción del reactivo con los
presentes en la orina, y se encontró la absorbancia incre-
mentaba hasta el minuto 5 de la reacción indicando que
ésta se ha completado.
conclusiones
Se concluye que sí se puede medir concentraciones de
en muestras de orina, en relación al rango de refe-
rencia.
Los valores de de pacientes diagnosticados con
son signicativamente mayores a los pacientes sa-
nos. Los valores promedio de pacientes sanos comparados
con estándares de dermatán son 8,38 mg/mL, condroi-
tin 6,54 mg/mL, y con heparán 7,58 mg/mL. Los valores
de pacientes con (condroitin) fueron 9,64 mg/mL
comparados con pacientes sanos que fueron de 6,54 mg/
mL por lo que concluimos que los valores en los pacien-
tes con son signicativamente más altos. La meto-
dología utilizada para clasicar las diversas del país
fue por electroforesis horizontal con una temperatura de
25°C, de agarosa al 2,5%. No fue posible obtener la sepa-
ración de los para su correcta identicación. Los va-
lores de pacientes con (dermartán y heparán) son
7,90 a 16,98 mg/mL comparados con pacientes sanos, que
van de 7,58 a 8,38 mg/mL. Los pacientes con (he-
parán) son 8,58 a 8,81 mg/mL comparados con pacien-
tes sanos que tienen un valor de 7,58 mg/mL. Los valores
promedio de pacientes es de 8,38 mg/mL de dermatán en
los pacientes sanos. El promedio de 6,54 mg /mL de con-
droitín en los pacientes sanos. El promedio de 7,58 mg/
mL de heparán en los pacientes sanos. En las muestras de
pacientes con , se obtuvieron concentraciones lige-
ramente mayores de queratán y condroitín, 9,64 mg/mL
comparados con sanos 9,54 mg/mL. Adicionalmente se
obtuvo en , concentraciones mayores de dermatán
y heparán, desde 7,90 y 16,98 mg/mL, comparados con
sanos 7,58 y 8,38 mg/mL.
La metodología utilizada para clasicar los diferen-
tes tipos de por electroforesis horizontal a una tem-
peratura de 25°C, con agarosa al 2,5%, no dio resultados
analíticos concluyentes. No fue posible obtener la separa-
ción de los para su correcta identicación. Se repitió
este análisis con una estricta revisión del mismo, pero no
se obtuvieron datos válidos.
conflicto de intereses
Ninguno reportado por los autores.
agradecimientos y patrocinio
Se expresa un fraterno agradecimiento a la Universidad
Central del Ecuador, a la Dirección de Investigación, a
la Unidad de Investigación Formativa, Facultad de Cien-
cias Químicas, Fundación Fepel Dasha. Los autores de-
claran que los recursos nancieros para la elaboración de
la presente investigación proceden del fondo de investi-
gación semilla de la UCE.
Pruebas bioquímicas para el tamizaje y diagnóstico oportuno de mucopolisacaridosis de población en riesgo
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Figura 13.2. Correlación ACP sin edadFigura 13.1. Correlación ACP sin edad
Figura 14. GAG’s ug/ml. Promedio al IC 95% edad(años). El valor promedio de GAG’s y su intervalo de conanza son utilizados para el cálcu-
lo de R cuadrado.
Figura 15. R2. De acuerdo con el valor de R2 éste es signicativo, lo que indica que no afecta la interpretación de variables signicativas. De esta
manera se comprueba la relación signicativa entre los GAG’s y la edad. El R2 indica que el modelo tiene un buen ajuste y, al examinar la grá-
ca de línea ajustada y la gráca de residuos, muestra relación entre GAG’s de pacientes con MPS y las edades de los pacientes.
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Evaluación de la actividad nootrópica del ácido clorogénico presente en el café para el tratamiento preventivo de enfermedades neurodegenerativas
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REVISTA QUÍMICA CENTRAL
Evaluación de la actividad nootrópica del ácido clorogénico presente en el café
para el tratamiento preventivo de enfermedades neurodegenerativas
Evaluation of the nootropic activity of the chlorogenic acid present in coee for the preventive
treatment of neurodegenerative diseases
Elda Molina
a
| Elithsine Espinel
b
| Dayana Borja
c
| Javier Santamaría | Carmita Reyes | Jorge Grijalva
f
| Roy Vera
g
a
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
e
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
b
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
f
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
c
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
g
University of Saskatchewan, Canadá
d
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
DOI: https://doi.org/10.29166/quimica.v7i2.3332 ISSN impresa 1390-5562
© 2021 Universidad Central del Ecuador ISSN electrónica 2477- 9121
Creative commons NoComercial 4.0 Internacional fcq.quimica.central@uce.edu.ec
, (), -, . -
e increase in neurodegenerative diseases has led to the search for products with nootropic activity as
adjuvants for the prevention or treatment of these pathologies. In this study, we aim to evaluate the noo-
tropic activity of the arabica coee pulp extract (Coea arabica) in small mammals. In the rst phase,
total phenols were quantied from the coee samples with the Folin-Ciocalteu method by using both dy-
namic and assisted maceration. Data were analyzed using and Duncan’s post-hoc test. In the se-
cond phase, twenty-four mice (Mus musculus) of 32.5 g on average were used. ese animals were split
up into four groups and assigned to one of the following treatments: water as negative control, Ginkgo
Biloba as positive control, and two doses of coee pulp extract. e mice were subjected to training and
learning tests in the eight-arm-radial and Morris’s aquatic labyrinth. e latency-time and time that each
mouse takes to visit the eight arms of the labyrinth were recorded. e extract of arabica coee pulp re-
ects nootropic activity, whose dose 100 mg/kg of weight/day of chlorogenic acid () contributes to
the improvement of cognitive properties.
El aumento de enfermedades neurodegenerativas ha conducido a la búsqueda de productos con activi
-
dad nootrópica para la prevención o tratamiento de esas patologías. En este estudio buscamos evaluar la
actividad nootrópica del extracto de la pulpa del café arábica (Coea arabica) en mamíferos menores. En
la primera fase se cuanticaron los fenoles totales en la pulpa de café mediante el método Folin-Ciocalteu
extraídos con maceración dinámica y asistida. Los datos se analizaron mediante y la prueba post-
hoc de Duncan. En la segunda fase se utilizaron 24 ratones (Mus musculus) de 32,5 g de peso promedio.
Los ratones fueron divididos en cuatro grupos y asignados a los siguientes tratamientos: agua (control
negativo), ginkgo biloba (control positivo) y dos dosis de extracto de pulpa de café. Los ratones se some-
tieron a pruebas de aprendizaje en el laberinto acuático de Morris y el laberinto radial de 8 brazos. Se re-
gistró el tiempo de latencia y el tiempo que demoraron los ratones en visitar los 8 brazos del laberinto.
El extracto de la pulpa de café arábica reeja actividad nootrópica, cuya dosis 100 mg/kg de peso/día de
ácido clorogénico () contribuye al mejoramiento de las propiedades cognitivas.
introducción
La actividad nootrópica tiene relación con las funciones
cognitivas del cerebro, dado que sus atributos consisten
en combatir la falta de concentración, la pérdida de me-
moria y la fatiga cerebral, cuyos síntomas se agravan con
la edad.
Las enfermedades asociadas con el deterioro cognitivo
(neurodegenerativas crónicas) se han incrementado pro-
gresivamente a nivel global provocando un panorama
de detrimento de la calidad de vida de los pacientes. En
general, las demencias primarias no son curables y pro-
ducen un daño progresivo e irreversible del cerebro. El
Recepción: 20/09/2021
Aceptación: 20/11/2021
Ácido clorogénico, actividad nootrópi-
ca, aprendizaje, memoria.
Received: 20/09/2021
Accepted: 20/11/2021
Chlorogenic acid, nootropic activity,
learning, memory.
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Alzhéimer, Parkinson y la degeneración frontotemporal
son enfermedades neurodegenerativas responsables del
50 al 60% del total de casos de demencia, como lo men-
ciona la Organización Mundial de la Salud,
(1)
y los costos
estimados de los tratamientos alcanzan 235 billones de
dólares anuales. Sin embargo, solamente el 11% de estos
costos corresponden a América Latina y el Caribe donde
viven cerca del 44% de las personas con demencia,
(2)
a
pesar de existir muchos casos de demencia. De hecho,
los presupuestos empleados en esta amplia región no son
sucientes, en razón de la falta de accesibilidad a los ser-
vicios médicos integrales tal como el Seguro Social en el
Ecuador, la falta de conocimiento de las enfermedades
neurodegenerativas y también por los altos costos que
representa este tratamiento.
La prevalencia de enfermedades neurodegenerativas
se incrementa conforme aumenta la edad de la población.
En el país, la esperanza de vida alcanza los 75 años y va
en aumento, según las cifras de la Encuesta Salud y Bien-
estar del Adulto Mayor realizada por el en el 2010
( y ). Sin embargo, esta cifra variará, proyectándo-
se un incremento a 80,5 años para el año 2050. Esta ten-
dencia, conjuntamente con un aumento de la proporción
de adultos mayores, se vería reejado en un escalamien-
to del desarrollo de algún tipo de demencia en la pobla-
ción. Por ejemplo, en la década de los 70 en Ecuador, los
adultos mayores representaban el 4,2% de la población to-
tal, y para el 2050, se espera un aumento al 16 por ciento
(Freire et al., 2010).
Considerando que dos de cada diez casos en el país
presentan deterioro cognitivo en adultos mayores de 60
años, el tamaño absoluto de la población con deterioro
cognitivo se incrementaría en similar magnitud, un com-
portamiento poblacional análogo a otros países de Amé-
rica Latina.
(4)
Por lo tanto, el desarrollo y acceso a tratamientos efec-
tivos es una prioridad, a sabiendas de que este tipo de en-
fermedades crece de manera exponencial a partir de los
65 años. Es por ello que este estudio, planteó evaluar una
alternativa basada en la utilización de productos natura-
les que estimulen las propiedades cognitivas, para bene-
cio de personas encaminadas hacia la tercera edad que
tienen antecedentes familiares de padecer enfermedades
neurodegenerativas.
En respuesta a esa realidad, el desarrollo y uso de fár-
macos con actividad nootrópica o también denominadas
drogas inteligentes,
(5)
en su mayoría de origen sintético,
se han incrementado. Sin embargo, el origen de las enfer-
medades neurodegenerativas también está relacionado
con factores genéticos y ambientales, incluyendo la die-
ta y el riesgo de padecer algún tipo de demencia.
(6)
Por
ejemplo, la alta ingestión de carbohidratos y gluten están
asociados con un deterioro cerebral acelerado. También,
elevados niveles de glucosa (indicadores como hemoglo-
bina A) se asocian con el estrés oxidativo y glicación
con efectos en el deterioro cognitivo y con enfermedades
tales como alzhéimer, parkinson, esclerosis múltiple, au-
tismo y depresión,
(7)
Al existir una aparente relación en-
tre la presencia del estrés oxidativo y el décit cognitivo,
se ha propuesto el uso de antioxidantes como terapia far-
macológica con el n de inhibir la formación de especies
reactivas de oxígeno (s) o bien promover su captura e
inactivación,
(8)
al fomentar el consumo de productos con
actividad antioxidante.
Con estos antecedentes, se ha intensicado la bús-
queda de fuentes de origen natural con propiedades an-
tioxidantes con la nalidad de prevenir o tratar dichas
patologías. El café es una de las bebidas más consumidas
y populares de todo el planeta, y en el país no es la ex-
cepción. Estudios recientes indican que algunos de sus
constituyentes, entre ellos, los compuestos fenólicos, re-
presentados por el ácido clorogénico, poseen propieda-
des antioxidantes.
(9)
Por lo tanto, esta investigación tiene
el objetivo de evaluar la actividad nootrópica del ácido
clorogénico presente en el extracto de café a través de
un estudio preclínico utilizando ratones como mamífe-
ros menores para el tratamiento de enfermedades neu-
rodegenerativas.
parte experimental
Se realizó un estudio experimental en dos fases. La pri-
mera fase consistió en cuanticar los fenoles totales para
cuyo propósito se procedió a identicar los parámetros
de calidad del café. La obtención de muestras de pulpa se
basó en la denición de parámetros de estabilidad, solu-
bilidad y concentración del principio activo. Este proce-
dimiento se llevó a cabo en el Laboratorio de Productos
Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas y en el
Laboratorio de de alimentos de la Universidad Cen-
tral del Ecuador. La segunda fase consistió en evaluar la
actividad nootrópica del extracto del café, utilizando 24
ratones de la especie Mus musculus /c como uni-
dades experimentales, con un peso promedio de 32,5g
(35± 5 g en machos y 30 ± 5 g en hembras). Estos ratones
fueron adquiridos en el Instituto Nacional de Salud Pú-
blica e Investigación y transportados de forma adecuada
e higiénica hasta las instalaciones de Centro de Biología
de la Institución.
En el Centro de Biología, se preparó un lugar especí-
co para el alojamiento de los animales, con condiciones
ambientales ideales de temperatura, humedad, ventila-
ción, alumbrado e interacción con otros animales, para
evitar problemas de estrés. Diariamente los animales re-
cibieron cantidades óptimas de alimentación y agua, de
acuerdo a sus requerimientos. De igual manera, recibie-
ron atención veterinaria especializada, para lo cual se usó
un programa de vigilancia sanitaria y prevención de en-
fermedades. De esta forma, se dio cumplimiento a los
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protocolos internacionales de bienestar animal estable-
cidos por la Organización Mundial de Sanidad Animal
().
DESCRIPCIÓN DE LA FASE 1
Control de calidad de la pulpa de café arábica
Se cosecharon alrededor de 2 kg de frutos de café arábi-
ca en estado maduro, es decir, 32 semanas después de la
oración.
(10, 11)
La pulpa de cada fruto se obtuvo por ex-
trusión y posterior secamiento a 50ºC durante 12 horas
hasta obtener entre 6 y 10% de humedad para facilitar la
molienda. Se determinaron las cenizas totales de todas
las muestras,
(12)
para estimar el valor nutricional del cafe-
to del cual provino la pulpa de café. Para conocer la carga
microbiana se realizó un control microbiológico antes y
después de la desinfección de la muestra con el n de
corroborar que dicha carga cumple con los límites esta-
blecidos por la Organización Mundial de la Salud ().
Finalmente, se determinó la bra cruda y grasa cruda,
cuyos valores se compararon con estudios previos.
(13)
Obtención de extracto etanólico y metanólico
Los extractos del café se obtuvieron a través de dos mé-
todos de extracción: maceración dinámica y maceración
asistida por ultrasonido, utilizando solventes metanol
y etanol: agua. Una vez concentradas las muestras, se
cuanticaron los fenoles totales de cada extracto, en tres
repeticiones por cada tratamiento que se describe más
adelante.
Maceración dinámica.- Consistió en someter la mues-
tra a una extracción sucesiva con agua: etanol al 96,6%
(50:50) y metanol al 99,9% en relación (1:10 w/v materia
seca/solvente) y con la ayuda de un agitador gravitatorio
a 200 rpm durante 20 horas a temperatura ambiente, se
centrifugó y se procedió a concentrar el extracto en un
rotavapor, a una temperatura de 40°C, hasta la mitad del
volumen inicial, luego de lo cual se almacenó a 0°C en
frascos ámbar hasta su posterior evaluación.
(14)
Maceración asistida por ultrasonido.- El procedimien-
to fue similar al método anterior, pero en lugar de ocupar
el agitador gravitatorio, se utilizó el equipo de ultrasoni-
do por 45 minutos y a 45 Khz.
(14)
Cuanticación de fenoles totales
La cuanticación de fenoles totales se determinó según
el método de Folin-Ciocalteu,
(15)
utilizando el ácido gá-
lico como estándar. Se prepararon soluciones patrones
de 500, 250, 150, 100, 50 ppm y por regresión lineal se
construyó una curva de calibración hasta obtener un co-
eciente de regresión de 0,9975.
DESCRIPCIÓN DE LA FASE 2
Administración de tratamientos
La administración de los tratamientos se realizó por vía
oral/día durante 7 semanas a un grupo de 24 ratones Mus
musculus (50% machos y 50% hembras), constituyendo
cada ratón una unidad experimental. En este estudio se
compararon cuatro tratamientos: como control negativo
se empleó el agua (0 mg/kg peso corporal); control posi-
tivo el ginkgo biloba (240 mg/kg peso corporal) y el ex-
tracto de la pulpa de café en dos dosis: dosis 1 (10 mg/ kg
peso corporal/ ), dosis 2 (100 mg/ kg peso corporal/
), con la proyección de encontrar la dosis segura para
futuros estudios clínicos. Cabe mencionar que se tomó
en consideración las dosis (tratamientos) del extracto
del café arábica, dado que el ácido clorogénico () es
el bioactivo que le conere la capacidad antioxidante a
dicha muestra.
(16)
La primera dosis fue adaptada del estu-
dio del Consejo Superior de Investigación Cientíca de
España y la Universidad de Granada que administran a
los animales de experimentación 10 mg () / kg cor-
poral / día (equivalentes a la ingesta de ácidos clorogé-
nicos por consumo moderado de café), con el objeto de
comparar el efecto antiglicante entre varios extractos de
café.
(17)
La segunda dosis de 100 mg () / kg corporal /
día se obtuvo sobre la base de productos comercializados
a nivel mundial con dicha concentración.
Los ratones se pesaron cada 8 días, durante el trans-
curso de dos semanas se realizaron las dos pruebas de
aprendizaje utilizando los métodos de laberinto acuático
de Morris y el laberinto radial de 8 brazos,
(18)
tal como se
explica a continuación.
Pruebas de aprendizaje
Los ratones fueron entrenados por cinco días consecuti-
vos en ambos laberintos, luego de lo cual se sometieron
a un período de evaluación de 7 días consecutivos, si-
guiendo el protocolo estipulado por Wenk.
(18)
En el laberinto acuático de Morris se empleó un tan-
que circular lleno de agua a una temperatura de 25°C y un
diámetro aproximado de 100 cm y de profundidad 30 cm.
El tanque se dividió en cuatro cuadrantes iguales, donde
se colocó una plataforma de escape cuadrada de 10 cm
de longitud. Durante el entrenamiento, el primer día se
sumergió la plataforma hasta los 8 centímetros de longi-
tud para que los ratones puedan observar la ubicación de
la misma; y, a medida que trascurrieron lo días de entre-
namiento, se procedió a sumergir en su totalidad la pla-
taforma hasta 1 cm por debajo de la supercie del agua,
posición que se mantuvo durante los siguientes días de
evaluación.
(18)
En el laberinto radial de 8 brazos se empleó un apa-
rato compuesto de 8 brazos / ramicaciones idénticas de
35 cm de longitud x 5 cm de ancho. Estas ramicaciones
fueron distribuidas radialmente y unidas a una plataforma
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central con un diámetro de 20 cm para acomodar a los
animales y permitir que se movilicen fácilmente entre los
brazos. El primer día, se ambientó a los ratones por 20 mi-
nutos con acceso libre a todos los brazos. Se colocaron dos
ratones para facilitar la adaptación y aclimatación, a par-
tir de segundo día hasta nalizar los días de evaluación,
se realizó este proceso individualmente.
Registro y análisis de datos
Cuanticación de fenoles totales.- Las muestras fueron
analizadas por triplicado en un barrido en el espectrofo-
tómetro - a 760 nm y los fenoles totales se expre-
saron en miliequivalentes de ácido gálico por mililitro
de muestra (meq GA/ml muestra). Estos datos a la vez,
se convirtieron en miliequivalentes de ácido clorogénico
por mililitro de muestra (meq / ml muestra) al re-
emplazar el peso equivalente de dicho bioactivos.
Pruebas de aprendizaje.- En el método de laberinto acuá-
tico de Morris se registró el tiempo de latencia, que con-
siste en el tiempo que cada ratón tardó en trasladarse
desde el punto de partida de este laberinto hasta llegar a
la plataforma y permanecer en ella durante 10 segundos.
Este procedimiento se repitió cuatro veces al día; para
ello, al ratón se le dejó descansar brevemente antes de
iniciar el siguiente ensayo durante 5 minutos por siete
días consecutivos.
En el método de laberinto radial de 8 brazos se re-
gistró el tiempo que transcurrió para que los ratones
visiten los 8 brazos del laberinto. En este ensayo se con-
sideró el número de desaciertos que tuvo cada ratón, es
decir, cuando el roedor ingresó más de una vez a un bra-
zo ya visitado. Este procedimiento fue repetido por sie-
te días consecutivos.
Análisis estadístico
Para los fenoles totales, se hizo un análisis de varian-
za () con el n de determinar diferencias entre
extractos de pulpa de café. Seguidamente se aplicó la
prueba post-hoc de Duncan
(19)
cuando los factores
en el resultaron signicativos. Estos procedi-
mientos se realizaron en el soware ..
Los datos obtenidos en las evaluaciones de aprendiza-
je fueron analizados utilizando un modelo lineal mixto
para considerar la estructura anidada de los datos en
el tiempo, evitando el problema de pseudo-replicación
temporal. En este modelo estadístico, los cuatro tra-
tamientos (dosis), el sexo de los ratones y los 7 días de
experimentación, además de las interacciones entre és-
tos, fueron analizados como factores jos; en tanto, las
cuatro repeticiones diarias del experimento se analiza-
ron como efecto aleatorio. Es decir, se consideró que la
respuesta en tiempo de latencia de los ratones no varía
durante las repeticiones diarias, sino que esta variación
del efecto de las dosis es observada en el transcurso de la
semana. Adicionalmente, la variable respuesta (tiempo
de latencia) fue transformada utilizando logaritmo natu-
ral. Esta transformación permitió ajustar adecuadamen-
te el modelo a los datos y cumplir con las asunciones de
normalidad, homogeneidad de varianzas y linealidad.
Finalmente, se aplicó un análisis post-hoc utilizando la
prueba de diferencias mínimas signicativas de Fisher
en casos donde los parámetros del modelo resultaron
signicativos.
Al igual que con el laberinto acuático de Morris, los
datos obtenidos en laberinto radial de 8 brazos fueron
analizados utilizando un modelo lineal mixto para con-
siderar la estructura anidada de los datos en el tiempo. En
este modelo estadístico, los cuatro tratamientos, el sexo
de los ratones y los 7 días de experimentación, además
de las interacciones entre éstos, fueron analizados como
factores jos. Adicionalmente, el número de desaciertos
fue colocado como covariable y los seis ratones o sujetos
experimentales se analizaron como efecto aleatorio. Por
tanto, se asumió que la respuesta en el tiempo de laten-
cia no varía dentro del grupo de ratones tratados con si-
milar dosis. En este procedimiento, la variable respuesta
(tiempo) fue transformada usando logaritmo natural para
cumplir con las asunciones de normalidad, homogenei-
dad de varianzas y linealidad, y se aplicó la prueba de di-
ferencias mínimas signicativas de Fisher como análisis
post-hoc en casos donde los parámetros del modelo re-
sultaron signicativos. Los procedimientos estadísticos
fueron ejecutados en el soware R.
(20)
resultados y discusiones
La identicación taxonómica de la planta de café prove-
niente del cantón El Carmen de la provincia de Manabí,
conrmó la especie Coea arabica. Los resultados de los
parámetros de control de calidad de la pulpa de café fue-
ron: 6,20% de humedad, 23% de bra cruda, 1,28% de
grasa cruda y 0,85% de cenizas totales (base seca). De
igual forma, los criterios de control microbiológico cum-
plen con lo establecido por la ,
(21)
para microorganis-
mos aerobios, enterobacterias, mohos y levaduras.
En la tabla 1, se puede observar los promedios de tres
muestras de los fenoles totales por los dos métodos de
maceración y los dos métodos de extracción. La mayor
cantidad de fenoles totales obtenidos del extracto de la
pulpa de café arábica se registró por el método de mace-
ración dinámica utilizando solvente etanol: agua 50:50 (P
< 0,05). Contrariamente, la menor extracción se alcanzó
con el método de maceración asistida por ultrasonido uti-
lizando metanol como solvente (ver Tabla 1).
De acuerdo con la tabla 1, la maceración dinámica acu-
só la mejor respuesta en la recuperación de fenoles totales,
debido probablemente a que la muestra permaneció mayor
tiempo en contacto con el solvente en comparación con la
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maceración asistida por ultrasonido. De otra parte, el sol-
vente etanol: agua arrojó mejores resultados, lo cual se ex-
plica por la presencia de agua que incrementa el volumen
del material vegetal, y por efecto, la supercie de contacto
con el solvente y la matriz vegetal. Se conoce que el agua in-
crementa la constante dieléctrica de la mezcla etanol: agua
y con ello la polaridad del solvente, lo que mejora la capa-
cidad extractiva por parte del solvente y probablemente de
la muestra que contenga compuestos anes a la polaridad,
tal como arman otros estudios realizados por varios au-
tores,
(22)
quienes concluyen que, a mayor contante dieléc-
trica, mayor es la concentración de polifenoles.
Las propiedades cognitivas aparentemente se ven in-
uenciadas por estímulos que inuyen en el aprendizaje,
tal como se puede observar en la gura 1 (ver Figura 1).
Al respecto, se destaca la existencia de roedores evaluados
en este trabajo, cuyo tiempo de latencia se incrementó, de-
bido aparentemente al miedo a ser introducidos a la pisci-
na, cuya emoción habría provocado que esos ejemplares
únicamente deambulen alrededor del lugar y no lleguen
a la plataforma, por causa de una condición de estrés.
(23)
De hecho, los procesos cognitivos como la memoria,
el aprendizaje y atención, están ligados a un condiciona-
miento del miedo, es decir, a la memoria emocional,
(24,
25)
incluso se ha demostrado que el estrés deteriora las ta-
reas de memoria hipocampo-aprendizaje, como se pue-
de observar en la gura indicada. De igual forma, en dos
pruebas de aprendizaje, se evidenciaron diferencias entre
hembras y machos, debido aparentemente a variables -
siológicas y comportamentales del individuo. Al respecto,
Marrocco y McEwen
(26)
sugieren la existencia de una rela-
ción entre hipocampo con las hormonas sexuales.
En la tabla 2, se registran los promedios del tiempo
de latencia en el laberinto acuático de Morris. No se re-
gistraron diferencias signicativas entre los tratamientos
Control y Ginkgo Biloba (P > 0,05), aunque esta variable
fue afectada por el sexo de los ratones y los días de evalua-
ción, tal como se evidencia en las guras 1 y 2, respectiva-
mente. La comparación entre dosis de extractos de pulpa
administrados, no reejaron diferencias estadísticas (P
> 0,05) en esta variable. La comparación entre los trata-
mientos Control y Ginkgo Biloba demuestra diferencias
(P < 0,05) respecto de los tratamientos a diferentes dosis
de extracto de pulpa de café (ver Tabla 2).
De acuerdo con los resultados expresados en la tabla
2 y gura 2, se evidencia, a partir del segundo día de eva-
luación, una disminución del tiempo de latencia. Sin em-
bargo, parece incrementar a partir del cuarto día, hecho
que probablemente se explique por cuanto al ser intro-
ducidos repetidamente los ratones, terminaron por ha-
bituarse al espacio, y consecuentemente, se tomaron más
tiempo de lo que normalmente realizaron en los prime-
ros días de evaluación (ver Figura 2).
En la tabla 3, se expresan los promedios de desacier-
tos obtenidos en el método de laberinto radial de 8 brazos
(ver Tabla 3). No se evidenciaron diferencias signicati-
vas entre los tratamientos control, ginkgo biloba y el tra-
tamiento con la dosis más baja de extracto de pulpa de
café (P > 0,05). Sin embargo, estos tres tratamientos ree-
jan diferencias respecto de la mayor dosis de extracto de
café administrado (P < 0,05). El sexo y día de evaluación
afectaron la respuesta animal, tal como se puede observar
en la gura 3, lo cual signica que conforme aumentó los
días de evaluación, disminuyó el número de desaciertos,
siendo más notorio en las hembras respecto de los ma-
chos (ver Figura 3).
De otra parte, se pudo observar que tanto los machos
como las hembras que fueron administrados el extrac-
to de la pulpa de café de concentración (10 mg/kilogra-
mo del peso corporal/día) requirieron mayor tiempo para
alcanzar el objetivo. Sin embargo, en el caso de los ani-
males que recibieron el extracto de la pulpa de café a con-
centración (100 mg/kilogramo de peso/día) acusaron el
mismo tiempo de latencia promedio independientemen-
te del sexo.
En el laberinto radial de 8 brazos, se observó que la
dosis de 10 mg/kilogramo del peso/día del extracto de la
pulpa café, incrementa únicamente la memoria de trabajo
y no la memoria espacial. Por el contrario, la dosis de 100
mg/kilogramo de peso/día del extracto, parece tener ma-
yor efectividad en ambos tipos de memoria, este asocia-
do al concepto de unión y las relaciones cuantitativas, es
decir, la relación dosis / concentración-respuesta, el cual
sugiere que la magnitud de los efectos farmacológicos dis-
tales inducidos por los ligandos es proporcional a la frac-
ción de ocupación de los receptores como lo mencionan
Waldman y Terzic,
(27)
por lo que se concluye que los 100
mg de ácido clorogénico administrados a los ratones ocu-
paron en su totalidad los receptores del sitio de acción.
conclusión
Se evaluó la actividad nootrópica del extracto de la pul-
pa de café arábica (Coea arabica) en animales menores
y se comprobó que el ácido clorogénico presente en el
extracto de la pulpa de café tiene actividad nootrópica,
y que la dosis 100 mg / kilogramo del peso corporal /día
de ácido clorogénico, demuestra mayor efectividad en el
mejoramiento de las propiedades cognitivas de aprendi-
zaje y memoria, hecho que podría beneciar a una po-
blación humana con problemas neurocognitivos o que es
propensa a padecerlos por sus antecedentes.
agradecimientos
Los autores agradecen al Centro de Biología, en especial
a la Dra. Vet. Daniela Balseca. De igual manera, al Labo-
ratorio de de Alimentos de la Universidad Central
Evaluación de la actividad nootrópica del ácido clorogénico presente en el café para el tratamiento preventivo de enfermedades neurodegenerativas
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Tabla 1. Promedio y desviación estándar de fenoles totales obtenidos de la pulpa de café en dos tipos de maceración y dos méto-
dos de extracción (etanol: agua y metanol)
Tipo de maceración Etanol: agua (meq ACG ml
-1
) Metanol (meq ACG ml
-1
)
Maceración dinámica
0,364 ± 0,00091 a 0,231± 0,00057 b
Maceración asistida por ultrasonido
0,258 ± 0,00065 bc 0,166 ± 0,00042 b
Letras distintas reejan diferencias estadísticas signicativas entre los cuatro valores (P < 0,05).
Tabla 2. Resultados del análisis estadístico de la variable tiempo de respuesta (s) en el laberinto acuático de Morris
Tratamientos Tiempo (s)
Control 17,32 ±15,20 a
Ginkgo Biloba 18,15 ±22,14 a
Extracto de la pulpa de café (10 mg ) 13,98 ±19,10 b
Extracto de la pulpa de café (100 mg ) 10,16 ±11,18 b
Letras diferentes muestran diferencias estadísticas signicativas (P < 0,05).
Figura 1. Memoria emocional. Variación en el tiempo de latencia de ratones machos y hembras, sometidos a dos dosis de extracto de café en el
laberinto acuático de Morris
Figura 2. Variación en el tiempo de latencia de ratones machos y hembras, sometidos a dos dosis de extracto de café, en función de los días de
evaluación en el laberinto acuático de Morris
Evaluación de la actividad nootrópica del ácido clorogénico presente en el café para el tratamiento preventivo de enfermedades neurodegenerativas
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Tabla 3. Resultados del análisis estadístico de la variable número de desaciertos en el laberinto radial de 8 brazos.
Tratamientos Número de desaciertos
Control 3,13 ±1,81 a
Ginkgo Biloba 3,33 ±2,39 a
Extracto de la pulpa de café (10 mg ACG) 2,17 ±1,51 a
Extracto de la pulpa de café (100 mg ACG) 2,07 ±1,47 b
Letras diferentes muestran diferencias estadísticas signicativas (P < 0,05).
Figura 3. Número de desaciertos de ratones machos y hembras, sometidos a dos dosis de extracto de café, en función de los días de evaluación
en el laberinto radial de 8 brazos
del Ecuador, y a la Dra. Isabel Fierro, exdecana de la Fa-
cultad de Ciencias Químicas.
conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conictos de interés.
financiamiento
Fondos de investigación del proyecto semilla «Determi-
nación de la actividad nootrópica en plantas de uso co-
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Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios
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REVISTA QUÍMICA CENTRAL
Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro
para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios
Use of Agrobacterium tumefaciens as a generator of tumors in vitro for the analysis of antitu-
mor activity of secondary metabolites
Andrea Parreño
a
a
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
DOI: https://doi.org/10.29166/quimica.v7i2.3301 ISSN impresa 1390-5562
© 2021 Universidad Central del Ecuador ISSN electrónica 2477- 9121
Creative commons NoComercial 4.0 Internacional fcq.quimica.central@uce.edu.ec
, (), -, . -
is review article discusses the potato disc assay developed between 1955 and 1982 using Agrobacte-
rium tumefaciens strains to generate tumors, we will see why it can be used to test antitumor activity of
various secondary metabolites and the advantages of this screening compared with other tests based on
cell lines in addition to the importance of its use in various current publications, especially in developing
countries where ancestral medicine is still widely used.
El presente artículo de revisión habla sobre el ensayo de disco de papa desarrollado entre los años 1955 y
1982 usando cepas de Agrobacterium tumefaciens para generar tumores, veremos por qué puede ser usa-
do para probar actividad antitumoral de diversos metabolitos secundarios estudiados y de las ventajas
que tiene este screening en comparación con otros ensayos a base de líneas celulares, además de la impor-
tancia de su uso en diversas publicaciones actuales, especialmente en países en vías de desarrollo donde
la medicina ancestral aún es ampliamente usada.
introducción
La agalla de corona es una enfermedad de carácter vege-
tal que infecta a la mayoría de las plantas dicotiledóneas,
su principal característica es producir agallas a nivel de
las raíces y cuello de las mismas. El microorganismo
causante de esta enfermedad es Agrobacterium tumefa-
ciens actualmente llamada Rhizobium radiobacter, que es
una bacteria móvil en forma de varilla, gram negativo,
perteneciente a la familia Rhizobiaceae. Esta bacteria in-
gresa a los tejidos vegetales a través de heridas frescas
en una amplia gama de plantas que, como se mencionó
anteriormente, incluyen muchas dicotiledóneas, aunque
Recepción: 20/09/2021
Aceptación: 20/11/2021
Ensayo de disco de papa, tumores,
inhibición, actividad antitumoral.
Received: 20/09/2021
Accepted: 20/11/2021
Potato discs assay, tumors, inhibition,
antitumoral activity.
Utilización de Agrobacterium tumefaciens como generadora de tumores in vitro para el análisis de actividad antitumoral de metabolitos secundarios
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también se observa la infección en pocas monocotiledó-
neas y algunas gimnospermas (Hajivand, 2013, citado
por Rahman et al., 2020).
Las cepas patógenas comparten la característica de
contener un plásmido llamado Ti por sus siglas en inglés
(tumor-inducing) de entre 200 y 800 pkb, el mecanis-
mo por el que infecta a la planta se debe a la transferen-
cia de del plásmido Ti a las células vegetales, los
genes insertados inuyen indirectamente en la biosín-
tesis de auxinas y citoquininas que causa una división
celular descontrolada y tumorigenicidad. La capacidad
de esta bacteria de transferir su es ampliamente
usado en varios bioensayos (Hajivand, 2013, citado por
Rahman et al., 2020), especialmente para la transforma-
ción y mejoramiento de plantas (plantas transgénicas),
trasformación de hongos y también para varios estudios
moleculares; además de estos ensayos A. tumefaciens
sigue siendo usada para evaluar actividad antitumo-
ral y antimitótica de diversos metabolitos; esta revisión
se enfocará en la importancia del uso de A. tumefaciens
como generador de tumores en discos de papa y revi-
saremos algunas investigaciones actuales donde sigue
siendo usada como screening inicial para compuestos
que recientemente son estudiados y que podrían tener
capacidades antitumorales.
ensayo de disco de papa como screening
inicial para el análisis de compuestos
con actividad antitumoral
El primer ensayo semicuantitativo para inducción de tu-
mores mediante A. tumefaciens fue desarrollado en 1955
por Klein y Tenenbau, quienes utilizaron tejido de raíz
de zanahoria, desafortunadamente debido a la limitada
utilidad que tenía para la evaluación bioquímica asocia-
da con la conversión de células normales a células tumo-
rales este tejido fue descartado y reemplazado por el en-
sayo realizado por Anand y Heberlein quienes probaron
los discos de papa; la simplicidad del procedimiento y la
homogeneidad del tejido, junto con el hecho de que el
bioensayo es cuantitativo, hizo que este sistema sea ideal
para la investigación bioquímica de compuestos con po-
sible capacidad antitumoral (1977).
Para el año de 1981 Galsky et al. compararon este en-
sayo con ensayos en líneas celulares. Tomaron la infor-
mación de varios compuestos con actividad antitumoral
probados en ensayos de leucemia de ratón (P388) y com-
pararon los mismos en el ensayo de disco de papa; obser-
varon que existía una posible correlación y establecieron
varias ventajas sobre otros modelos celulares. También se
demostró que la acción antitumoral de estos compuestos
no era por antibiosis (incapacidad de organismos de vivir
en inmediaciones de otros) ni por inhibición de la unión
bacteriana a los sitios de unión al tumor.
En estudios preliminares entre 1980 y 1983, efectuados
en la Universidad de Purdue, se modicó el ensayo de
disco de papa de Galsky para hacerlo un ensayo de rutina
y ser usado como preselección antitumoral en extractos
crudos de plantas. Dentro de las modicaciones hechas
existen dos que son las más notables: 1. Usar (di-
metil sulfoxido) como solvente universal para los extrac-
tos de plantas; y 2. usar una solución de yodo / yoduro
de potasio para teñir las células de fondo que contie-
nen almidón, es decir, las células no tumorales (norma-
les) para facilitar el conteo de tumores (Ferrigni et al.,
1982), además de las modicaciones hechas probaron su
efectividad con una evaluación estadística apropiada y
se observó que los resultados del cribado de plantas del
ensayo de disco de papa estaban fuertemente asociados
con los resultados de 3PS (P388), con lo que denitiva-
mente se concluyó que este ensayo podría emplearse ru-
tinariamente y que podía ser usado como una preselec-
ción comparativamente rápida, económica, segura, que
ahorra animales y es estadísticamente conable para la
actividad antitumoral in vivo (Ferrigni et al., 1982, cita-
do por McLaughlin & Rogers, 1998).
ensayo de disco de papa
El ensayo de Ferrigni et al., con las modicaciones he-
chas por Galsky es el ensayo de elección, algunos inves-
tigadores lo modican dependiendo de las necesitades
del estudio, pero generalmente el protocolo inicia con un
cultivo 48 horas de A. tumefacies en medio de extracto de
levadura (), que es ajustado a 1 x 10
9
con dimetil
sulfoxido ().
Por otro lado, se lavan y desinfectan papas Russet (So-
lanum tuberosum L.), utilizando hipoclorito de sodio, se
cortan para que la supercie quede sin cáscara; éstas se
colocan nuevamente en hipoclorito de sodio para su des-
infección y se procede a cortar en el centro de la papa
con ayuda de un taladro de corchos de aproximadamen-
te 10 mm de diámetro; al cilindro obtenido se le cortan y
descartan los extremos y el restante es fraccionado en ci-
lindros más pequeños de 5 mm de espesor, todo esto se
realiza bajo condiciones asépticas y en cámara de ujo.
Los cilindros obtenidos se colocan en una placa con
agar al 1,5% y se inoculan con 50 µl la mezcla de extracto
(solución)/agua/bacteria apropiada y se incuban a tem-
peratura ambiente durante 12 días.
Al nalizar el tiempo de incubación, los discos se ti-
ñen con reactivo de Lugol y son observados en un micros-
copio de disección, donde se puede evidenciar el tejido de
papa de color azul oscuro a marrón y los tumores de co-
lor crema a naranja.
Para calcular el porcentaje de inhibición se conside-
ra la siguiente fórmula:
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El ensayo previamente descrito eventualmente se
utiliza como parte de un screening inicial para eval-
uar actividad biológica en plantas debido a su bajo
costo y al fácil uso por lo que esto resulta ser una
ventaja para preseleccionar extractos y ampliar el
estudio de su actividad antitumoral en caso de ob-
tener una inhibición importante de tumores.
su uso como screening inicial de com-
puestos con capacidades antitumorales
en investigaciones actuales.
En la búsqueda de nuevos medicamentos para tratar dife-
rentes enfermedades los investigadores observan la medi-
cina tradicional o medicina ancestral y las diferentes plan-
tas usadas en ésta. Para empezar a analizar la actividad
antitumoral de dichas plantas y los extractos obtenidos de
éstas, el ensayo de disco de papa resulta ser una de las pri-
meras opciones debido a su bajo costo y facilidad de im-
plementación. Actualmente existen varias publicaciones
donde se reere la utilización de este ensayo, por lo que en
este apartado se resumirán las más relevantes.
Myanmar es un país en vías de desarrollo conocido
como el jardín botánico del mundo por su alta produc-
ción de plantas medicinales. Aquí, según la Organización
Mundial de la Salud (), aproximadamente el 80% de la
población depende exclusivamente de esta medicina, por
lo que Lae et al. en su estudio quisieron determinar las ca-
racterísticas toquímicas y algunas actividades biológi-
cas de los extractos obtenidos de Phyllanthus Albizzioides,
una planta medicinal muy usada. En esta investigación
se encontró que el extracto etanólico de la corteza del ta-
llo mostraba una signicativa inhibición de tumores pro-
vocados por A. tumefaciens en disco de papa, además se
encontró fuerte actividad antioxidante, antimicrobiana y
antidiabética de estos extractos; el autor concluye que su
estudio puede contribuir con el uso extendido de los tallos
de la planta en la medicina tradicional de su país (2019).
Otra revisión actual donde se muestra el uso de este
ensayo es el realizado por akur et al., la investigación
proporciona información sobre valores nutricionales, to-
química y aspectos farmacológicos modernos de un fru-
to muy utilizado en la India llamado manzana de madera
(Feronia limonia), que ha sido subutilizada y descuidada.
La investigación utilizó el disco de papa para evaluar acti-
vidad antitumoral y aunque se encontró que esta era poco
signicativa, se llegó a la conclusión que este fruto tiene
diversas capacidades medicinales que se necesitan conti-
nuar investigando (2020).
En el artículo publicado por Tun et al., se evaluó la
actividad antitumoral de los extractos obtenidos de los
tallos de Allamanda cathartica L, se encontró que los ex-
tractos de etanol, acetato de etilo y éter de petróleo tenían
una signicativa inhibición de los tumores, dependiente
de la concentración de los mismos. Por otro lado, se en-
contró actividad antioxidante y antimicrobiana especial-
mente en los extractos con etanol, por lo que los autores
concluyen que el estudio podría contribuir a que los ta-
llos de A. cathartica se puedan utilizar en la formulación
de la medicina tradicional, además de que se puede con-
tinuar investigando su capacidad antitumoral con otros
ensayos en líneas celulares más complejas (2020).
perspectiva/punto de vista
El Ecuador es un país megadiverso con gran variedad de
vegetación, dentro de las plantas que han sido reportadas
la cuarta parte son endémicas y de estas el 7% fueron
catalogadas como útiles (De la Torre et al., 2008)
El 60% de estas plantas halladas en Ecuador tienen
usos medicinales, pero aún falta seguir investigando y
profundizando el estudio de los metabolitos contenidos
y sus propiedades bioquímicas y biológicas; como ha que-
dado evidenciado en los estudios reportados en este ar-
tículo de revisión el ensayo de disco de papa es viable y
económico como screening inicial para determinar pro-
piedades antitumorales, sin embargo, en el Ecuador no se
ha reportado su uso estandarizado destacando así la im-
portancia de desarrollar esta metodología y además ais-
lar y mantener la cepa de A. tumefenciens generadora de
tumores para que pueda ser usada como un ensayo de ru-
tina en nuevas investigaciones.
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Nanoemulsion de liberación controlada de ibuprofeno con lecitina de soya
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REVISTA QUÍMICA CENTRAL
Nanoemulsion de liberación controlada de ibuprofeno con lecitina de soya
Controlled release nano-emulsion with ibuprofen and soy lecithin
Pablo Bonilla
a
| Mariel Bonilla
b
a
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
b
Universidad Central del Ecuador, Ecuador
DOI: https://doi.org/10.29166/quimica.v7i2.3283 ISSN impresa 1390-5562
© 2021 Universidad Central del Ecuador ISSN electrónica 2477- 9121
Creative commons NoComercial 4.0 Internacional fcq.quimica.central@uce.edu.ec
, (), -, . -
In the present work have been made O/W (oil in water) nano-emulsions using soy lecithin, water, and
blends of soy, canola, corn, and sunower oils. ese formulations were studied to determine their e-
ciency as drug delivery systems for lipophilic drugs. e nano-emulsions were composed of two phases:
the oil phase which contained an amount of model drug (Ibuprofen) on it, and the aqueous phase that
was distilled water. e surfactant used was food grade soy lecithin. e elaboration of the nano-emul-
sions was made using high energy methods of agitation such as vortex, ultra turrax homogenizer, and
point ultrasound. To characterize the nano-emulsions were used dynamic light scattering equipment
(DLS), which allows us to measure the size of the droplets. To determine the stability of the nano-emul-
sions were made measurements with optical microscopy and with an atomic force microscope (AFM).
rough the characterization, we determined the emulsions with major stability, and we proceed to make
the drug release tests in a dissolution apparatus coupled with an Ultraviolet-visible Spectrophotometer
to study the release kinetics of the pharmaceutical form.
En el presente trabajo se elaboraron nanoemulsiones de tipo O/W a partir de lecitina de soya, agua y
mezclas de aceites de soya, maíz, canola y girasol; estas formulaciones se estudiaron para determinar su
ecacia como medio de transporte de un fármaco lipofílico. Se solubilizó previamente la mayor cantidad
de fármaco modelo en la fase oleosa, para la fase acuosa se utilizó agua tipo I; como surfactante se utili-
zó lecitina de soya grado alimenticio. Para la elaboración de las nanoemulsiones se utilizaron métodos
de alta energía como agitación Vortex®, homogeneizador UltraTurrax® y ultrasonido. Para caracterizar
las nanoemulsiones se utilizó un equipo de dispersión de luz dinámica (DLS), el cual permitirá medir el
tamaño de gota, además para determinar la estabilidad se midió el potencial Z de la nanoemulsión, tam-
bién se realizaron observaciones al microscopio y determinación del tamaño de gota en el microscopio
de fuerza atómica (AFM). Se realizaron pruebas de liberación del fármaco en un equipo de disolución
acoplado con un espectrofotómetro UV-vis, que se utilizó para encontrar la cinética de liberación de la
forma farmacéutica elaborada comparándola con estándares comerciales. El ensayo de liberación de las
formulaciones permitió obtener aquélla que dio el mayor porcentaje de liberación del principio activo
con una cinética de liberación controlada.
introducción
Las nanoemulsiones son dispersiones líquido-líquido
que son cinéticamente estables, éstas tienen un tamaño
de gota del orden de los 100 nanómetros. Sus tamaños de
partícula pequeños permiten que exista mayor área de
supercie y que tengan mayor estabilidad.
(1, 2)
Las propiedades sicoquímicas que tienen efecto sobre
una nanoemulsión son:
1. velocidad de disolución en la formulación;
2. tamaño de partícula y cristalinidad del fármaco;
3. pH de la formulación y pKa del fármaco;
Recepción: 31/08/2021
Aceptación: 15/12/2021
Nanoemulsión, lecitina de soya,
liberación controlada, microscopio
fuerza atómica.
Received: 31/08/2021
Accepted: 15/12/2021
Nano-emulsion, soy lecithin, drug deli-
very system, atomic force microscopy.
Nanoemulsion de liberación controlada de ibuprofeno con lecitina de soya
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4. lipolicidad del fármaco;
5. viscosidad de la formulación, afecta a la difusión
del fármaco hacia los tejidos.
3
Mediante procesos de alta energía como la cizalla obte-
nida por medios mecánicos se puede mejorar la estabili-
dad de los sistemas coloidales, a n de evitar el proceso
de maduración de Otswald. Este mecanismo depende
del grado de polidispersión de las gotas y de las interac-
ciones entre éstas.
(4
a translucent oil in water emulsion (a
so-called ‘miniemulsion’
)
En el desarrollo de esta investi-
gación no solo se busca mejorar la estabilidad en la for-
mulación de una emulsión con un principio activo muy
insoluble como el ibuprofeno, sino también mejorar la
solubilidad del mismo dispersando dicho activo en una
matriz oleosa de aceites vegetales de los cuales el me-
jor resultado fue obtenido al dispersar en aceite de soya
ayudado de un tensioactivo de origen vegetal lecitina de
soya.
(5, 6
unpredictable plasma concentrations. Drugs can
be delivered in a controlled pattern over a long period
of time by the controlled or modied release drug de-
livery systems. ey include dosage forms for oral and
transdermal administration as well as injectable and im-
plantable systems. For most of drugs, oral route remains
as the most acceptable route of administration. Certain
molecules may have low oral bioavailability because of
solubility or permeability limitations. Development of
an extended release dosage form also requires reasonable
absorption throughout the gastro-intestinal tract (GIT
)
Cinética de liberación de fármacos
La concentración del fármaco depende de cinco proce-
sos: liberación, absorción, distribución, metabolismo y
eliminación.
(7)
parte experimental
MATERIALES Y REACTIVOS
Reactivos:
·
aceite de soya puro, donación empresa de aceites y
grasas, 10 ml;
·
lecitina de soya grado alimenticio, compra comercial
5 gramos;
·
ibuprofeno en polvo del 99,7% de pureza, donación
empresa farmacéutica, 1 gramo;
· agua tipo ;
· fosfato monobásico de sodio, , Sigma-Aldrich.
Materiales:
·
20 tubos de ensayo de 20 cm de largo y 1 cm de diá
-
metro con tapa;
· 10 pipetas plásticas desechables de 3 ml;
· bolsas de diálisis Cellu-Sep, 12.000-14.000 daltons;
· ltros de de 0,2 micras;
·
micropipetas de 10,10 y 5000 microlitros de capacidad.
Equipos:
·
balanza analítica, marca Mettler Toledo, precisión: ±
0,0001 𝑔;
· vortex mixer, marca Fischer Scienti;
· ultra turrax ,marca , modelo T10BS1;
·
placa de calefacción con agitador analógico y magné-
tico de laboratorio con 5 posiciones, marca , mo-
delo 5 Power. Puestos de agitación sincronizados
de 0 a 1100 rpm;
·
ultrasonido puntual, modelo 130, potencia 130 W;
· disolutor, marca Colplay con 6 posiciones;
· calorímetro diferencial de barrido, Q2000;
·
equipo de dispersión de luz dinámica (), marca Ho-
riba SZ 1000;
· espectroscopio UV-vis, marca Varian;
·
microscopio de fuerza atómica, marca Park System,
modelo NX10.
MÉTODOS
Formulación de nanoemulsiones
Las nanoemulsiones se realizaron mezclando primero el
fármaco modelo con el aceite o mezcla de aceites; de esta
manera se determinó la máxima solubilidad del fárma-
co modelo en la fase oleosa, después se procedió a pesar
una cantidad de lecitina y se calentó la mezcla hasta 60°C
con agitación en vortex durante 3 minutos y Ultra Turrax
durante 5 minutos, a la mezcla anterior se le añadió una
cantidad especíca de agua. Finalmente, para disminuir
el tamaño de partícula se agitó la nanoemulsión por ul-
trasonido a 33% de potencia durante 3 minutos.
Caracterización de nanoemulsiones
Para caracterizar las nanoemulsiones se determinó su
pH, conductividad y se utilizó colorante a la grasa y co-
lorante acuoso para determinar si la emulsión es / o
/. Para determinar la interacción del fármaco con el
aceite se realizaron lecturas en el calorímetro diferen-
cial de barrido (). Además, se midió el tamaño pro-
medio de partícula y la polidispersión en un equipo de
dispersión dinámica de luz () Horiba SZ-100. Con
este mismo equipo se determinó el potencial Z de la na-
noemulsión para determinar su estabilidad mediante la
separación de cargas. También se realizaron observacio-
nes al microscopio y mediciones del tamaño de partícula
mediante un lente acoplado al microscopio; se determi-
nó el tamaño de gota con el microscopio de fuerza ató-
mica (), para comparar el tamaño de gota obtenido
por los diferentes métodos de caracterización.
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Estabilidad de las nanoemulsiones
Para medir la estabilidad de las nanoemulsiones se mi-
dió la altura de separación de fases, su temperatura de
descomposición, también se observaron las nanoemul-
siones en el microscopio después de 1 mes y se realizó la
curva de distribución de tamaños y, nalmente, se cen-
trifugó las nanoemulsiones para observar su estabilidad
y además medir la cantidad de fármaco presente en cada
una de las fases de separación.
Pruebas de liberación controlada de fármaco
Medio de Liberación: Se preparó una solución de fosfato
monobásico de sodio () 0,2 N y se ajustó con NaOH
hasta un pH de 7,2.
Condiciones Sink: La concentración de ibuprofeno di-
suelto en no debió exceder el 0,04% de ibuprofeno
por cada 100 g de solución de .
La formulación de las nanoemulsiones se realizó varian-
do la cantidad de tensioactivo, agua y aceite, además se
variaron los tipos de aceite y al nal se eligió las formu-
laciones con mejores características sicoquímicas y fue-
ron las que contenían aceite de soya. Todas las mezclas de
aceites se realizaron en una proporción de 50/50. El ibu-
profeno fue previamente solubilizado en el aceite o en las
mezclas de aceites hasta alcanzar su máxima solubilidad.
Se prepararon nanoemulsiones de tipo /. En el gráco
de la gura 1 se identican las regiones del triángulo de
Gibbs de las mejores formulaciones (ver Figura 1).
En el diagrama ternario se observa que las formula-
ciones seleccionadas se encuentran en el área izquierda
del triángulo de Gibbs, esta zona se caracteriza porque el
porcentaje de agua es mayor al del aceite y del tensioac-
tivo, además en esta zona se forman emulsiones del tipo
/. El fármaco fue disuelto en el aceite previamente a la
formulación de las nanoemulsiones.
resultados y discusión
CARACTERIZACIÓN DE LAS NANOEMULSIONES
Tipo de nanoemulsión
Se determinó que las nanoemulsiones obtenidas eran
/, mediante prueba de colorantes.
Calorimetría diferencial de barrido ()
Se utilizó calorimetría de barrido diferencial () para
determinar la interacción existente entre el fármaco y el
aceite de la emulsión (ver Figura 2).
En los termogramas de la gura 2 se observa el pico de
fusión del ibuprofeno en una matriz de aceite de soya,
se puede ver que el pico no es tan denido como el pico
del ibuprofeno solo y la temperatura de fusión bajó a
71,92°C, esto se debe a su interacción con el aceite, por lo
que baja su punto de fusión según propiedades coligati-
vas. Además, se puede identicar que en ambos casos la
entalpía (H) es positiva, por lo tanto, al fusionarse los
sistemas absorben energía; sin embargo, en el caso del
ibuprofeno micronizado la entalpia es mayor que en el
sistema del aceite con el ibuprofeno, es decir, el fármaco
solo absorbe más energía que el fármaco en la matriz de
aceite de soya.
DISPERSIÓN DE LUZ DINÁMICA
Polidispersión
Se observó que la polidispersión disminuye al utilizar la
agitación con ultrasonido. Los valores de la polidisper-
sión en ambos casos fueron menores a 0,5, lo que nos
indica que los tamaños de gotas de las formulaciones
tienden a distribuirse alrededor de un valor medio y con
ligera dispersión lo que hace de estas nanoemulsiones
más estables. Se realizó el análisis de varianza de la poli-
dispersión en el equipo y señala que las varianzas no
son iguales entre las formulaciones y tampoco son igua-
les al ser agitadas con ultrasonido y sin ultrasonido.
Potencial Z
Los valores promedio del potencial zeta para las na-
noemulsiones fue de entre -48 y -87 mV los cuales son
valores menores a -25 mV, esto nos demuestra que las
nanoemulsiones son estables puesto que las fuerzas de
repulsión son mayores que las de atracción y disminuye
el riesgo de que las gotas se unan y se inicien procesos de
maduración Otswald.
Ensayos de liberación
Los resultados de los ensayos de liberación se describen
en la gura 3, en la cual se comparan los procesos de
difusión acumulativa del principio activo con el tiempo
y se llega a establecer que en comparación con una for-
mulación de ibuprofeno comercial que es de liberación
rápida, las formulaciones de la presente investigación
son de liberación retardada debido a que se llega a por-
centajes de alrededor del 60% luego de alrededor de 16
horas, mientras la forma comercial llega a la liberación
total del fármaco alrededor de las 8 horas (ver Figura 3).
Cinética de liberación
Se determinó la cinética de liberación que siguen las na-
noemulsiones propuestas para establecer si son formas
farmacéuticas de liberación controlada. La formulación
IS2TB tiene una cinética de liberación controlada que si-
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Figura 1. Diagrama de fases para las nanoemulsiones elaboradas
Figura 3. Comparación de los porcentajes de liberación de las formulaciones preparadas y de las formulaciones comerciales.
Figura 2. Termogramas del ibuprofeno y del fármaco en la matriz de la nanoemulsión
71.21°C
85.12°C
76.42°C
74.88°C
140.8J/g
71.92°C
62.70°C
50.10J/g
76.42°C
74.88°C
140.8J/g
8
6
4
2
0
2
HeatFlow(W/g)
30 40 50 60 70 80 90 100
Temperature(°C)
IBUPROFENOmicronizado.001–––––––
IBU+aceite.001–––––––
ExoUp UniversalV4.7ATAInstruments
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Tabla 1. Valor del factor de correlación R2 para la cinética de liberación
Orden
Cinético/
Formulación
3A20 IH3 IS2TB S+I 8M/G Suspensión
Comercial
Cápsula
blanda
Orden 0 0,8956 0,9342 0,8490 0,7559 0,9189 0,3892 0,2433
Orden 1 0,8012 0,7596 0,7219 0,4886 0,8012 0,3702 0,1834
Orden 2 0,5897 0,4796 0,5268 0,2194 0,4856 0,3489 0,1423
Higuchi 0,9348 0,9403 0,9261 0,8721 0,9648 0,6222 0,4334
Figura 4. Cinética de liberación. Formulación IS2TB
Figuras 5-6. Imágenes de nanoemulsión en microscopio de fuerza atómica
Izquierda: Imagen 2-D Derecha: Imagen 3-D
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gue el modelo de Higuchi, el coeciente de correlación
obtenido con este modelo cinético fue de 0,9261. La -
gura 4 describe los valores para determinar el tipo de ci-
nética (ver Figura 4).
En la tabla 1 se observa los valores de los coecientes
de correlación comparativos de las diferentes cinéticas y
de las diversas formulaciones en comparación con los de
la cinética de Higuchi lo que corrobora el hecho que to-
das las formulaciones obtenidas son de liberación retar-
dada y la formulación IS2TB es la que mejor se ajusta en
su valor de correlación. Los valores de correlación de las
formulaciones de ibuprofeno comerciales son de rápida
liberación y no siguen una cinética determinada sea de
primero, segundo u orden cero (ver Tabla 1).
Microscopía
Se realizó la determinación del tamaño de gota mediante
y se obtuvo tamaño de gota promedio de 195,6 nm.
Las guras 5 y 6 describen la topografía de las gotas de la
nanoemulsión IS2TB en plano 2D y 3D, respectivamente
(ver Figuras 5 y 6).
conclusiones
Se elaboraron nanoemulsiones de liberación controlada
con lecitina de soya y con un fármaco lipofílico (ibupro-
feno). Se obtuvieron cinco fórmulas estables 3A20, IH3,
S+I, IS2TB y 8M/G, a las cuales se les realizó los ensa-
yos de liberación para determinar la formulación más
efectiva, es decir, aquélla que liberó la mayor cantidad de
fármaco lipofílico considerando que el ibuprofeno tiene
baja solubilidad en medios acuosos. Se caracterizaron
las nanoemulsiones elaboradas mediante diferentes téc-
nicas. Con los resultados obtenidos se concluye que la
mejor nanoemulsión fue IS2TB, la cual es estable debido
a que el valor del potencial Z es menor a –25 mV. En
cuanto a la polidispersión se determinó que la nanoe-
mulsión seleccionada poseía una polidispersión menor
a 0,5. Además, existe una posible relación o formación
de enlaces débiles entre el fármaco y el vehículo lo que se
determinó mediante el termograma al desplazarse el
punto de fusión del fármaco. En cuanto al , la mor-
fología de las gotas de la nanoemulsión es denida por la
capa de lecitina que rodea la misma y le conere fortale-
za mecánica para resistir deformaciones o rupturas y así
evitar procesos de desestabilización o coalescencia. La
formulación que libero mayor cantidad de principio acti-
vo fue la nanoemulsión IS2TB, compuesta por la mezcla
de aceites de soya/girasol en una proporción de 50/50;
esta formulación contenía una cantidad de ibuprofeno
de 0,28% y fue estable incluso después de 3 meses de pre-
parada, esta formulación presentó una cinética de libera-
ción controlada del modelo de Higuchi con el valor más
alto de correlación de 0,9261.
conflicto de intereses
Los autores declaran de manera explícita, no tener con-
ictos de intereses que pudieren haber sesgado los resul-
tados incluidos en el manuscrito.
agradecimientos y patrocinio
A los técnicos docentes y autoridades de la Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecua-
dor por dar las facilidades de uso de las instalaciones e
insumos para llevar a cabo este trabajo.
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INTRODUCCIÓN
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La función de esta sección es presentar objetivamente los principales resultados y su interpretación en una secuencia
lógica. No debe incluir detalles experimentales y debe redactarse en tiempo pasado. Se recomienda utilizar tablas,
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esquemas y guras para mostrar los resultados. No debe presentarse el mismo resultado en tablas y en guras. De ser
necesario indicar el procedimiento estadístico empleado para analizar los resultados y reportar el nivel de signican-
cia utilizado. Debe relacionarse los resultados del artículo con lo encontrado en otros estudios similares.
CONCLUSIONES
Esta sección resume brevemente las principales conclusiones del trabajo y no debe ser un duplicado de la información
del resumen (abstract) ni repetir puntos de la discusión. La conclusión debe estar basada en la evidencia presentada.
AGRADECIMIENTOS OPCIONAL
Esta sección puede usarse para agradecer discusiones de otros investigadores o asistencia técnica de personas que no
son coautores del trabajo. También puede agradecerse la asistencia económica o donación de reactivos.
REFERENCIAS
Deben listarse y enumerarse todas las referencias bibliográcas en el orden que aparecen en el manuscrito. En el texto
del manuscrito, la referencia se cita usando números arábigos como superíndices, después de un punto o una coma.
No deberá incluirse en la referencia material bibliográco que no haya sido señalado explícitamente con un número
en el texto. Los nombres de revistas deben ir abreviados. Para el formato de las referencias utilizar las guías de la Ame-
rican Chemical Society ().
INFORMACIÓN DE SOPORTE
De requerirse en esta sección se puede añadir información extra que ayuda a entender o evidenciar o resaltar un hecho
o discusión abordado en la parte de discuciones.
ecuaciones
Las ecuaciones deben estar enumeradas consecutivamente, con el número entre paréntesis (1) y alineado a la derecha.
Se puede utilizar el editor de ecuaciones de Word o MathType.
estructuras químicas
Las estructuras químicas deben dibujarse usando cualquier programa para el efecto como ChemDraw formato
1996, /Draw, ChemSketch u otros.
caracterización de compuestos
Para todos los compuestos nuevos, debe proveerse evidencia que permita establecer su identidad y grado de pureza.
La evidencia de la identidad de compuestos nuevos debe incluir espectros de -, -, o datos de
análisis elemental. Para compuestos sintetizados, y que han sido previamente reportados en la literatura, debe citarse
el método de preparación y los datos de la bibliografía las técnicas empleadas para determinar su pureza.
figuras, esquemas y tablas
Todas las guras, esquemas y tablas deben mencionarse en el texto en orden consecutivo y numeradas independiente-
mente con números arábigos. Los esquemas y las guras llevaran la descripción al nal del gráco, pie de gura. Esta
descripción debe ser clara y permitirá entender la gura sin necesidad leer el cuerpo del manuscrito. Las imágenes
deben directamente en el cuerpo del manuscrito en formato o . Las tablas estarán en formato de Word o
similar y no insertadas como imagen, el título de cada tabla debe ir en la parte superior de la tabla. Comprobar que
las leyendas sean legibles.
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bibliografía recomendada
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de Bates College: http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/writing/toc.html
Coghill, A. M. & Garson, L. R. (Edits.). (2006). e Style (ed.). e Style Guide: Eective Communication of Scientic
Information (third ed.). New York: Oxford University Press.
Day, R. A (2005). Còmo escribir y publicar trabajos cientícos (tercera ed., vol. 598). (M. Sáenz, Trad.) Washington, : Organi-
zación Panamericana de la Salud.
Esta revista, que usó tipografía Minion Pro tamaño
11, se terminó de diagramar para su versión digital en
Editorial Universitaria en el mes de diciembre de 2021
siendo rector de la Universidad Central del Ecuador el
Dr. Fernando Sempértegui Ontaneda y director de Edi-
torial Universitaria el Prof. Gustavo Pazmiño.
Uso de la nanotecnología para el desarrollo de empaques alimenticios del sector pesquero
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