Se recolectó muestras de estiércol y contenido ruminal “in situ” en el camal de faenamiento Familia Aldaz, con la finalidad de aislar microorganismos celulolíticos presentes en aquellos residuos. Se empleó el método propuesto por Leguizamon y Tique (2008), se trazó una malla sobre el material a recolectar y se procedió a tomar muestras de las intersecciones de dicha malla.

Las muestras se recolectaron con una espátula esterilizada con alcohol al 70%, se las mezcló en un balde plástico, la muestra compuesta fue introducida en bolsas ziploc estériles con objeto de mantener la humedad. Para transportar la muestra se usó un cooler que mantuvo la cadena de frío, evitando la reproducción y metabolismo de microorganismos nativos.

Se utilizó 1 L de medio mineral líquido (NaNO₃:2,5 g; KH₂PO₄: 2,0 g; MgSO₄: 0,2 g; NaCl: 0,2 g y CaCl₂•6H₂O: 0,1 g, en 1 L de agua destilada, para revitalizar los microorganismos presentes en el estiércol y contenido ruminal. Para asegurar que únicamente proliferen los microorganismos aerobios que presenten actividad celulolítica, se usó como fuente de carbono papel filtro, en una proporción del 3% respecto a la cantidad total de medio mineral. El papel filtro se lo cortó en trozos de aproximadamente 1 cm. Se esterilizó vía calor húmedo en autoclave durante 15 min hasta alcanzar los 121 °C y 1 atm de presión.

Se elaboró un biorreactor, que contenía 1 L de medio mineral esterilizado y frío con el 3% de inóculo, es decir, 30 g de la muestra de estiércol y contenido ruminal y 30 g de papel filtro, este proceso se llevó a cabo a temperatura ambiente (20 °C) y con 2 g/L de O₂. Se realizaron observaciones cada 5 días, para apreciar la degradación del papel filtro y controlar temperatura y la cantidad de oxígeno, este proceso se lo hizo durante 15 días. El día 12 se detectó la suspensión del aumento de la temperatura del biorreactor, por lo que se cubrió con material concentrador de calor y se colocó cerca lámparas. El tiempo de observación se extendió a 17 días luego de los cuales se realizó la siembra de bacterias y hongos en medios específicos.

Cepas bacterianas

Macroscopía. Se realizó la siembra de bacterias en medio TSA se llevó a incubación durante 48 h a 37°C, posteriormente se realizó la caracterización macroscópica, con base en los siguientes criterios: “tamaño de las colonias (puntiforme, pequeñas, medianas, grandes); color; forma (regulares, redondas, ovaladas, irregulares, filamentosas, rizoides); elevación de las colonias (plana, elevada, convexa monticular); bordes (entero, ondulado, aserrado, filamentoso y rizado); superficie; olor (amoniacal, fétido, dulzón) y crecimiento (abundante, moderado, escaso)” (Escobar et al., 2012).

Cepas fúngicas

Macroscopía. Se realizó la siembra de hongos en medio Agar Sabouraud, su proliferación demoró siete días a temperatura ambiente; posteriormente se observó los bordes, exudado, color, olor, forma y claves taxonómicas (Escobar et al., 2012) de los hongos desarrollados.

Se realizó la reactivación de las cepas seleccionadas mediante la adición de nutrientes

Bacterias. Fueron reactivadas en caldo BHI, para esto se definió la escala Macfarland en la que se encontraban los microorganismos, que para el caso de Proteus mirabilis (M3) y Citrobacter freundii (M13) se encontraban en escala 10 Macfarland, posteriormente se los introdujo en la incubadora a 37 °C durante 24 horas (Universidad de Antioquia, 2009).

Hongo. Para Penicilium spp., se sembró sus esporas en 8 mL de caldo BHI, se llevó a incubación a 67°C por 24 horas y se realizó el recuento celular en la cámara de Neubauer.

La concentración celular según Arredondo et al., (1997) se calcula de acuerdo a la fórmula (ecuación 1):

Ec. (1) C = N * 1 0 4 * dil

En donde:

C = cél/mL

N = promedio de células presentes en 1 mm² (0,1μL)

dil = factor de dilución

Una vez reactivadas, la cantidad de inóculo para las pilas de compost fue seleccionada de forma aleatoria y experimental considerando el recuento celular fúngico y la escala Macfarland.

Los inóculos fueron colocados en tubos de ensayo estériles debidamente sellados, etiquetados y llevados al área experimental en cooler manteniendo la cadena de frío.

Los inóculos fueron colocados en el centro de las pilas a una profundidad aproximada de 30 cm.

Los materiales empleados para la creación de pilas de compost fueron: estiércol vacuno, contenido ruminal, aserrín, urea y melaza. La cantidad de material empleado se determinó de manera experimental; con una relación C: N inicial calculada de 34,15, este valor se encuentra dentro del rango óptimo establecido por la FAO (2013).

Se crearon 12 pilas de compost, cada tres pilas fueron asignadas con un tratamiento específico. Las pilas fueron creadas sobre plástico lo cual facilitó su recubrimiento, la retención de los materiales a compostar y la prevención de contaminación del suelo con lixiviados.

Antes de iniciar con el proceso de control, se realizó un recuento inicial de bacterias y hongos, a fin de asegurar su presencia en las pilas de compost. Se realizó a los 3 días de creación de las pilas, para ello se tomaron 2,5 g de cada pila de compost y se adicionaron 50 mL de agua destilada, se homogenizó las soluciones madre por agitación y mediante el método de diluciones seriadas (hasta 10-4) se procedió a la siembra por extensión de bacterias en agar Antibiótico 19 con un periodo de incubación de 48 h a 35°C y hongos en agar OGY con periodo de siete días para su desarrollo.

Posteriormente, se controlaron parámetros como: temperatura, pH, aireación y humedad, durante todo el proceso de compostaje, según lo indica la tabla 1. Los datos registrados permitieron realizar correcciones in situ a fin de que el proceso produjera un compost inocuo y con cantidades óptimas de macro nutrientes.

Tabla 1 Tabla 1 Parámetros de control

Parámetros de control	Método	Aparato de medición	Marca del aparato	Lugar de medición	Frecuencia de medición
Temperatura	Lectura directa del aparato	Termómetro digital (- 50°C - +300°C)	SUNNEX	In situ		Dos veces a la semana
pH	Química seca	Tiras indicadoras del pH	Merck	In situ		Dos veces a la semana
Aireación	Volteo manual de pilas	N/A	N/A	In situ		Dos veces a la semana
Humedad	Método gravimétrico de desecación en estufa de aire caliente	Estufa de aire caliente Balanza analítica	Memmert ADAM	LABFIGEMPA		Una vez a la semana

Los análisis físicos, químicos y microbiológicos sobre muestras de compost maduro, se realizaron en el laboratorio de Química Agrícola y Suelos de la Facultad de Ciencias Agrícolas y en los laboratorios del Centro de Biología de la Universidad Central del Ecuador, respectivamente. Los análisis físicos realizados se basaron en el aspecto general de la pila de compost, es decir, se evaluó su color y olor. Los análisis químicos realizados fueron: la temperatura, el pH, el porcentaje de humedad, el porcentaje de materia orgánica, conductividad eléctrica, nitrógeno, fósforo y potasio. Mientras que los análisis microbiológicos comprenden: presencia de Coliformes fecales (E. Coli) y Coliformes totales.

Además, se realizó el conteo final de bacterias y hongos a fin de comparar la disminución de microrganismos debido al efecto propio del proceso de compostaje. Se lo realizó a los 88 días de creación de las pilas, una vez terminado el proceso de compostaje.

En la tabla 2 se muestran los análisis realizados y sus respectivos métodos.

Tabla 2

¹ Para la determinación de coliformes fecales se realizaron diluciones seriadas hasta 10^-2 (de la solución madre) debido a que en diluciones mayores las placas presentaron crecimiento estadísticamente no válido para ser reconocidos como resultados.

Estos indicadores se aplicaron para evaluar cada tratamiento debido a que no se pudo realizar la prueba de Tukey ya que no existió diferencia significativamente estadística entre tratamientos.

Los indicadores cualitativos fueron: color marrón oscuro y olor a tierra. Mientras los indicadores cuantitativos se muestran en la tabla 3, y permitieron definir qué tratamiento fue el mejor en términos de calidad de compost maduro, reducción del tiempo del proceso de compostaje y características del microorganismo inoculado.

Tabla 3

¹ re: valor real, obtenido de las pilas de compost.

² rf: valor referencial, obtenido de bibliografía similar.

Para esta investigación se empleó un diseño completamente al azar (DCA) por ser un método ampliamente usado en el campo de la experimentación agrícola y a nivel de invernaderos. Este diseño tiene una amplia aplicación cuando las unidades experimentales son bastante homogéneas, es decir que los factores actúan por igual en estas unidades.

Este análisis estadístico conjuntamente con los indicadores anteriormente mencionados permitió seleccionar el tratamiento que redujo la mayor cantidad de desechos orgánicos y que produjo compost de buena calidad.

Se recolectó una muestra compuesta de 200 g de estiércol y contenido ruminal para realizar el aislamiento de microrganismos celulolíticos aerobios nativos.

Bacterias

De las cajas inoculadas para crecimiento de bacterias se consideraron como resultados estadísticamente válidos a los expuestos en la tabla 4.

Tabla 4

UFC: Unidades formadoras de colonia

En estas cajas las colonias bacterianas fueron evaluadas con los criterios macroscópicos precedentes. Así, en la tabla 5 se muestra la macroscopía observada.

Tabla 5 Tabla 5 Macroscopía de colonias bacterianas

Código de colonia	Macroscopía de las colonias identificadas
M1	Redondas cóncavas, de borde irregular y de color crema.
M3	Cóncavas, de borde regular, rosadas y chiclosas.
M4	Cóncavas, de borde regular y coloración amarilla..
M6	Cóncavas, de borde regular y de color crema.
M8	Cóncavas, de borde regular y coloración amarillo intenso.
M11	Cóncavas, de borde regular, rosadas y con un punto central muy notorio.
M13	Convexas, de borde irregular y de color crema.

La Microscopía se realizó mediante pruebas bioquímicas según lo expuesto por Madigan et al., (2009), se realizaron seis pruebas que se indican en la tabla 6.

Con los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas más los criterios macroscópicos y las características específicas de las diferentes especies bacterianas descritas teóricamente, se seleccionaron para la investigación las cepas de las especies Proteus mirabilis y Citrobacter freundii.

Cepas fúngicas

En las cajas inoculadas para crecimiento de hongos, se evidenció el crecimiento de una única especie de hongo de color verdoso, algodonoso y amarillo en su parte posterior (Figura 1), que mediante la técnica de la cinta pegante y el microcultivo (Martí et al., 1998) se observó la morfología típica del género Penicillium (Figura 2), género que se caracteriza por la degradación de materia orgánica; por consiguiente, también se empleó a la cepa fúngica Penicillium spp. para el desarrollo de la investigación.

Figura 1 Figura 1 Macroscopía de cepa fúngica: Hongo verdoso

Figura 2 Figura 2 Morfología de Penicillium spp

Tabla 6

Nomenclatura: K: Base; A: Acido; NA: No Admite; -: negativo; +: positivo

Resultados del recuento celular para Penicillum spp. en la cámara de Neubauer mostrados en la tabla 7.

Tabla 7 Tabla 7 Conteo de células para Penicillum spp.

Cuadrícula
A	194
B	38
C	45
D	79
TOTAL	356
PROMEDIO	89

Las cantidades de inóculo empleadas para cada tratamiento descritas en la tabla 8.

Tabla 8 Tabla 8 Cantidad de inóculo por pila de compost

Tratamientos	Microorganismo a inocular	Cantidad de inóculo en mL/pila	1 Cantidad total de microorganismos
T1	Proteus mirabilis	10	30 x 109 UFC
T2	Citrobacter freundii	10	30 x 109 UFC
T3	Penicillium spp.	0,4	356 x 103 CÉLULAS
TB	Sin adición de microorganismos	0	N/A

Las cantidades de materiales utilizados para cada pila de compost, se encuentran detalladas en la tabla 9.

Tabla 9 Tabla 9 Formulación base

Material de partida	Cantidades
Estiércol vacuno + contenido ruminal	132 Kg
Aserrín	4 Kg
Urea	30 g
Melaza	4 L

El recuento inicial y final de bacterias y hongos en las pilas se observan en las Tablas 10 y 11.

Tabla 10

Se tomó la dilución 10^-1 debido a que se encuentra en el rango estadísticamente válido de 30 y 30

Tabla 11 Tabla 11 Recuento inicial de hongos

Tratamiento	Repetición	Dilución 1	R. inicial UFC/g	R. final UFC/g
T3	R1	10-1	-	5
		10-2	5	2
		10-3	-	1
		10-4	5	-
	R2	10-1	1	1
		10-2	6	1
		10-3	-	-
		10-4	3	-
	R3	10-1	2	-
		10-2	7	1
		10-3	-	1
		10-4	5	-

Se observó que en la dilución 10^-1 de crecimiento de cepas fúngicas en el recuento inicial, esto se debe a la aparición de setas de la especie de Coprinuscomatus como se muestra en las figuras 3 y 4. Y el crecimiento de levaduras de la especie Rhodotorula, estas son colonias rojas brillantes y se muestra en la figura 5. Ambas especies halladas pueden ser estudiadas en proyectos futuros como degradadores de hidrocarburos.

Figura 3 Figura 3 Seta de Coprinuscomatus

Figura 4 Figura 4 Esporas de Coprinuscomatus a 40X.

Figura 5 Figura 5 Levadura Rhodotorula

La fase del proceso de compostaje evaluada fue la fase termófila debido a que en ella el proceso alcanza la mayor temperatura del proceso, así, TB alcanzó 44 °C, T1: 44,9 °C, T2: 46,0 ºC y T3: 42,5 °C. La FAO (2013) establece el rango óptimo para esta fase de 45 °C a 70 °C. Según Pravia (2001) citado en Eche (2013) menciona el rango de 40 °C a 75 °C “para eliminar todos los organismos mesófilos patógenos, hongos, esporas, semillas y elementos biológicos indeseables”. En estudios realizados por Gordillo y Chávez (2008), al usar poblaciones microbianas locales la temperatura fue menor a los 45 °C mientras que al utilizar microorganismos comerciales la temperatura superó los 60 °C. De este modo, la existente entre los resultados de la investigación y estudios previos radica en la utilización de diferentes tipos de inóculos microbiológicos y materiales a compostar empleados.

El pH final para el tratamiento T3 fue de 9,04 muy seguido del tratamiento T2 con pH de 9,05, según la FAO este debe situarse entre 6,5 a 8,5 por lo que ningún tratamiento cumple con este parámetro. En la Norma Chilena 2880 (INC, 2003) los valores óptimos están ente 5 y 8,5 mientras que Olivares et al. (2012) obtuvieron un pH de 7,42 con una remoción por semana, diferente al realizado en este estudio en el cual se removía cada tres días para controlar humedad. Mientras que Pérez et al. (2008) obtuvieron valores de 7,8. La diferencia se debe principalmente a la interacción del estiércol con los residuos vegetales utilizados, que para este estudio fue melaza, estiércol, aserrín y urea.

El mayor porcentaje de humedad registrado en la investigación sucedió en T3 con 52,91% muy superior al rango de la FAO que oscila entre 30 a 40%, mientras que en la Norma Chilena 2280 (INC, 2003) está entre 30 y 45%. Sin embargo, Pérez et al. (2008) obtienen un valor de humedad de 52,2% al utilizar estiércol caprino y cascarilla de arroz, valor muy similar a los resultados obtenidos en el tratamiento T3.

El valor final máximo registrado fue 80,0% para T2; en estudios realizados por Pérez et al. (2008) reporta 42,8% de materia orgánica en su producto final; sin embargo, Naranjo (2013) obtiene un valor de 23, 08%. Según Abad et al. (1993) citado en Pérez et al. (2008) reportó valores superiores al 80% en compost en residuos de origen animal que aseguran una mayor reserva de nutrientes, este valor coincide con el tratamiento T2, en la tabla 12 se indican los resultados.

Tabla 12 Tabla 12 Porcentaje final de materia orgánica

Tratamiento	Media %
TB	77,8
T1	75,5
T2	80,0
T3	76,2

Se obtuvo un valor máximo de 82,5%en T1 y un mínimo de 79,1% en T3 como se observa en la tabla 13. La FAO (2013) menciona que durante el proceso de degradación se pierde hasta un 50% de material inicial, en contraste con los datos de este estudio, se demuestra claramente que la utilización de inóculos microbiológicos mejora la reducción de las cantidades de materiales usados para la creación de pilas de compost. La elevada cantidad de material degradado es un “indicador de la velocidad de descomposición de la misma” Hernández et al. (2013).

Tabla 13 Tabla 13 Porcentaje de material degradado

Tratamiento	Media %
TB	80,7
T1	82,5
T2	81,0
T3	79,1

Los valores de conductividad eléctrica obtenidos oscilan entre 14,1 – 20,2 mmhos/cm, como se muestran en la tabla 14, que al compararlos con valores de conductividad existentes en suelos muy salinos (mayores a 8 mmhos/cm) se considera un sustrato orgánico altamente salino. Esta afirmación se corrobora según lo expuesto por Andrade (2016) donde se alcanzó un valor máximo de 9,13 mmhos/ cm, siendo este un valor óptimo cuando se usan residuos animales según lo expone su investigación. Según la Norma Chilena 2880 (INC, 2003) para un compost clase B cuyo valor máximo de conductividad oscila entre 5-12 mmhos/cm. La conductividad eléctrica se encuentra directamente relacionado con la cantidad de sales disueltas en el compost esta tiende a aumentar durante el compostaje debido a la mineralización de la de la materia orgánica lo que a su vez genera el aumento en la concentración de nutrientes, guarda relación con las concentraciones de Ca²⁺, K⁺ y Na⁺ (Cariello et al, 2007).

Tabla 14 Tabla 14 Conductividad eléctrica en compost maduro

Tratamiento	Media %
TB	14,1
T1	19,6
T2	20,2
T3	14,3

El porcentaje de nitrógeno reportado oscila en el rango de 3,7% a 4,0% en base seca, según Hernández et al. (2013) (tabla 15) que oscilan entre 2% a 1,5%, afirmando que el estiércol vacuno no es una buena fuente de aporte de nitrógeno en comparación con la gallinaza; afirmación que se contrapone con los resultados obtenidos en esta investigación. Olivares et al. (2012) establecieron un porcentaje de nitrógeno del 2%. Mientras, Andrade (2016) obtuvo un valor máximo de nitrógeno de 1,6%, lo que indica que el compost obtenido en este estudio es rico en nitrógeno en comparación a productos provenientes de procesos de degradación similares.

Tabla 15 Tabla 15 Porcentaje de nitrógeno en compost maduro

c	Media %
TB	3,9
T1	3,7
T2	4,0
T3	3,8

Se obtuvo entre 0,02% y 0,03% de fósforo (tabla 16) valores que cumplen con el valor óptimo establecido para fósforo (menor o igual a 0,1%) en la Norma Chilena 2880 (INC, 2003), lo cual alega que se trata de un compost con buena proporción de fósforo que será útil para “cultivos sensibles al stress de fósforo” (Norma Chilena 2880, 2003). Comercialmente, el compost obtenido no puede competir con otro tipo de abonos orgánicos, pues como lo exponen Paul y Clarck (1996) citado en Soto y Muñoz (2002), un compost aceptable comercialmente presenta valores de fósforo dentro del rango óptimo de 0,15 a 1,5%.

Tabla 16 Tabla 16 Porcentaje de fósforo en compost maduro

Tratamiento	Media %
TB	0,03
T1	0,03
T2	0,02
T3	0,02

Se reportaron valores de 0,73% y 0,70%, según la tabla 17, estos valores coinciden con la investigación realizada por Andrade (2016), donde el potasio se encuentra en un rango de 0,6% a 1,5%. Datos similares (1,05% de potasio) son reportados por Pérez et al. (2008). La FAO (2013), establece el rango óptimo de 0,3% a 1% que “mejora el régimen hídrico de la planta y aumenta su tolerancia a la sequía, heladas y salinidad” (FAO, 2013). Hernández et al. (2013) obtuvieron 0,55% de potasio, este valor también es reportado en el estudio de Castillo et al. (2010). Al igual que con el fósforo, existen factores que provocan una mayor o menor cantidad de potasio en el compost maduro.

Tabla 17 Tabla 17 Cantidad de potasio en compost maduro

Tratamiento	Media %
TB	0,70
T1	0,73
T2	0,73
T3	0,73

Los valores obtenidos según la tabla 18 son muy bajos o nulos respecto al valor dado por la Norma Chilena 2880 (INC, 2003), donde un compost debe presentar valores menores a 1000 NMP/g de coliformes fecales para ser considerado de buena calidad e inocuo. Estos bajos resultados demuestran que en la fase termófila la temperatura fue elevada durante el tiempo necesario para higienizar las pilas, eliminando patógenos como Escherichiacoli.

Tabla 18 Tabla 18 Recuento de colonias de Escherichiacoli

Tratamiento	E. Coli NMP/mL
TB	18
T1	-
T2	3
T3	-

Por otro lado, para coliformes totales se reporta el valor máximo de 54 NMP para el tratamiento T1 como se muestra en la tabla 19, este valor no puede ser comparado con el establecido en la Norma Chilena 2880 debido a que en ella se pide valores únicamente para el género Enterobacter y el grupo coliformes totales comprende más de un género de bacteria como: Klebsella, Citrobacter, Escherichia.

Tabla 19 Tabla 19 Recuento de colonias de Coliformes totales

Tratamiento	Coliformes totales NMP/mL
TB	500
T1	54
T2	277
T3	346