Las muestras del tejido vegetal fueron tomadas de las plantas con síntomas de marchitamiento (Figura 1a, b, c, d), las muestras recolectadas fueron pequeñas porciones del pseudotallo, en las cuales se logró identificar presencia de haces vasculares de coloración café-rojiza (típico de la enfermedad) como se muestra en la Figura 2a, se tomaron a una altura de 80 cm del pseudotallo, con un cuchillo desinfectado con etanol al 70 %, extrayéndose un fragmento de este, en forma rectangular (5 cm de ancho x 10 cm de largo x 2 cm de espesor, aproximadamente), según lo descrito por Delgado et al. (2016). Se fueron extrayendo las diferentes capas externas del pseudotallo hasta lograr obtener una porción con haces vasculares necrosadas, comúnmente entre la tercera y cuarta capa (Figura 2b). Estas muestras se colocaron de forma individual en una funda plástica estéril, debidamente identificada, para poder ser almacenada en una hielera antes de ser transportada al laboratorio.

Figura 2.

Figure 2. Samples of pseudostem with presence of moko on plantain, a) sample extraction, b) presence of the bacterium in the center of the pseudostem.

Los tejidos vasculares con signos característicos de la bacteria en las muestras se cortaron en pequeños fragmentos (1 cm x 1 cm) y se sumergieron en un tubo de ensayo que contenía 9 ml de agua destilada. Después de cinco minutos de incubación a temperatura ambiente (el agua del tubo se volvió turbia debido a la exudación de células bacterianas de los extremos cortados del tejido enfermo), luego se tomaron 100 µl de una dilución con concentración 10^-7 UFC/ml. Esta suspensión bacteriana diluida se vertió sobre la superficie de un medio solidificado de Kelman (1954), agar de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC o TZC), preparado según la guía establecida por García et al. (2019) para la diferenciación de cepas virulentas, de las no virulentas (Tabla 1). Finalmente, la suspensión bacteriana se extendió sobre la superficie del medio TTC, con un asa triangular estéril, las placas inoculadas fueron incubadas a 37 °C durante 24 horas.

Tabla 1

Table 1. Guide for the preparation of the TTC culture medium .

Para aislar el patógeno del suelo se tomó 1 g de la mezcla de muestra de suelo, se diluyó en un tubo que contenía 9 ml de agua destilada estéril, se mantuvo en agitación manual por 5 min y después se tomaron 100 µl de la dilución con concentración 10^-7 UFC/ml, luego se sembró en cajas Petri estériles que contenían el medio TTC, se incubó de la misma forma que en los tejidos vasculares. Este proceso se realizó por triplicado, a los dos tipos de muestras (vegetal y suelo). Después de la incubación se observaron los diferentes tipos de colonias, utilizando las características expuestas por los diferentes autores. Para colonias virulentas debían tener las siguientes características: ser de color blanco con centros rosados, y las colonias no virulentas de color rojo oscuro, secas, redondas, opacas, arrugadas y no fluidas (Fornos Blanco et al., 2021; Obrador Sánchez, 2016; Obregón Barrios et al., 2011).

Tinción Gram: se desarrolló con la metodología descrita por Sharma y Singh (2019). Se fijó la muestra en el portaobjetos, se colocó el cristal violeta, luego la muestra se sumergió en lugol, se enjuagó con alcohol, finalmente se bañó en safranina (colorea de rosa-rojizo a las bacterias Gram negativas), luego se observó bajo el microscopio, a un aumento de 100x, para determinar su forma y coloración. Esta prueba se realizó por triplicado.

Prueba de hidróxido de potasio (KOH): esta prueba se considera como específica para comprobar los resultados de la prueba antes descrita sin el uso de coloración (Silva Romeiro, 2001). Se colocaron aproximadamente 50 µl de KOH al 3 % (p/v), en un portaobjetos de vidrio, la muestra de la bacteria fue transferida asépticamente desde las placas de agar, sobre los 50 µl de KOH, con la ayuda de un asa estéril y se mezcló las células (si la viscosidad de la gota produjo un incremento considerablemente, son células Gram negativas) (Sharma & Singh, 2019). Esta prueba se realizó por triplicado a cada muestra.

La prueba de catalasa se realizó de acuerdo con los métodos descritos por Sharma y Singh (2019), para esto se añadió una gota de una solución al 3 % de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en un portaobjetos, y se añadió con ayuda de un asa estéril, una muestra del cultivo de la bacteria desde una placa de agar (la liberación de burbujas del cultivo se registró como catalasa positiva). La producción de burbujas de gas da una pista sobre la presencia de bacterias aeróbicas y facultativas (Razia et al., 2021). Esta prueba se realizó por triplicado a cada muestra.

Prueba de oxidación-fermentación: una vez preparado el medio de Hugh y Leifson, se inoculó por picadura (se introduce el asa, con el inóculo en un tubo conteniendo agar en columna, sin tocar las paredes del tubo y en forma paralela, asegurándose que el inóculo quede distribuido a lo largo de toda la punción) (Reynoso et al., 2015). Se realizó este procedimiento para cada muestra en dos tubos distintos, uno en condiciones de aerobiosis (sin parafina) y otro en circunstancias de anaerobiosis (con parafina). Se procedió a incubar las muestras por el lapso de 48 h a 37 °C, según el protocolo de Apolinario Carmona (2018), si ambos tubos se encontraran acidificados luego del tiempo de incubación, la bacteria corresponderá a un metabolismo fermentativo para el carbohidrato utilizado; al contrario, si el tubo aeróbico estuviera acidificado, la bacteria sería oxidativa.

Prueba de indol: en esta prueba se usó un método semejante al utilizado por Apolinario Carmona (2018). Se trabajó con un tubo de ensayo que contenía 7 ml de caldo caseína-peptona-glucosa (CPG), al que se inoculó con el patógeno e incubó por 24 h a 37 °C. Luego se tomó una pequeña alícuota de 2 ml, a la cual se le añadió el reactivo de Kovacs, con eso podemos determinar si se produjo indol (Kaiser, 2021) Esta prueba se realizó por triplicado para cada muestra.

Prueba de Kligler hierro agar: se preparó el medio de Kligler según la descripción del producto comercial (Rossi, 2021), inmediatamente se distribuyó a un tubo de ensayo. Este proceso se ejecutó nuevamente por cada repetición. Luego se dejó reposar, para enfriar en una ubicación inclinada de manera que se formó un pico de flauta profundo, para luego ser inoculado como corresponde; se sembró en estrías, en un tubo que contenía agar pico de flauta, usando la técnica de la picadura (Reynoso et al., 2015). Finalmente se incubó durante 24 horas a 37 °C. Para la lectura de resultados, se tomó en cuenta tres partes importantes: primero pico/fondo (si la reacción es ácida será amarilla - A y si la reacción es alcalina será roja – K); segundo la producción de gas (fue leído como positivo o negativo al igual que el tercero), y tercero la producción de ácido sulfhídrico (H₂S) (Hossain et al., 2021). Esta prueba se realizó por triplicado a cada prueba.

Prueba de hidrólisis de almidón: se prepararon placas de agar nutritivo que contuvieron 0,2 % de almidón soluble (p/v), se rayaron con los aislados y se incubó a 37 .C, hasta observar un fuerte crecimiento, luego las placas se inundaron con solución de IKI (lugol), la que contenía yodo a razón de 1 g; yoduro de potasio, 2 g; y agua destilada, 100 ml. Una zona clara alrededor de una colonia se registró como reacción positiva (Sharma y Singh, 2019).

Antes de observar los efectos que causan, un crecimiento o decrecimiento en los aislados de la bacteria en un cultivo in vitro, se tomó en cuenta los otros factores que puede influir en la presencia o ausencia de este patógeno, tales como las propiedades químicas del suelo y/o las condiciones del medio ambiente en donde crece la bacteria.

En el cantón El Carmen, provincia de Manabí, Ecuador, se afirma la presencia de las cepas virulentas en seis muestras de tejidos vegetales y en tres muestras del suelo, las cuales se registraron en el mapa epidemiológico generado como resultado de la investigación, como se puede observar en la Figura 3, en el mapa se describen las coordenadas de toma de muestras y la altura sobre el nivel del mar de cada punto.

Figura 3

Figure 3. Epidemiological map generated as a result of the research.

Hubo dificultades al momento de obtener aislados viables del suelo; el mayor problema es el crecimiento rápido de otros microorganismos en las cajas de agar, dificultades que también enfrentó Obrador Sánchez (2016), a pesar de que se indica que las poblaciones de la bacteria en el suelo son mayores al estar a menos de 1 m de distancia de las plantas con síntomas y de 0 a 10 cm de profundidad (Obregón Barrios et al., 2011).

Al añadir la información de la zona de donde fueron tomadas las muestras de tejido vegetal y suelo con resultados positivos para presencia de R. solanacearum, el Plan de Desarrollo y Ordenamiento Territorial del cantón El Carmen (Gobierno Autónomo Descentralizado Municipal de El Carmen, 2015) indica una media de altura de 350 metros sobre el nivel del mar (m s.n.m.) y en la investigación de Bautista-Montealegre et al. (2016), en donde no se presentó la bacteria en las fincas a partir de los 1.676 m s.n.m., pero bajo esta altura existía incidencia de esta y en cuanto a la temperatura los resultados del Plan de desarrollo y ordenamiento territorial (Gobierno Autónomo Descentralizado Municipal de El Carmen, 2015) indican que en el cantón varía entre los 22 y 25 °C, con una humedad promedio del 80 % (Figura 3), lo que conlleva a que la sensación térmica pueda llegar a elevarse sobre los 28 °C, si lo comparamos con lo obtenido por Bautista-Montealegre et al. (2016) quien ubicó a fincas enfermas sobre un piso térmico templado, mientras que a las fincas sanas dentro de los climas fríos o extremadamente fríos, las cuales presentaron temperaturas promedio de 8 a 17 °C, se lograría comprobar lo descrito por Champoiseau et al. (2009) quienes indican que la temperatura mínima óptima de crecimiento es 28 °C y que bajo los 4 °C de temperatura se ve decaída (Bhanwar, 2022), siendo la temperatura óptima de crecimiento los 35 °C (SENASICA, 2019), mientras que Goszczynska et al. (2000) delimitan la temperatura de crecimiento a 41 °C, y aunque El Carmen no tenga una temperatura óptima se encuentra dentro de un rango en el que sí logra un crecimiento favorable del patógeno.

Los análisis químicos que se realizaron al suelo de las fincas plataneras arrojaron los siguientes resultados (Tabla 3), el pH tanto en el suelo de zonas enfermas, como en zonas sanas fue ligeramente ácido, es decir, entre un rango de 6,0 y 6,5 esto según Cartagena Ayala (2002), ya que se obtuvo en las fincas enfermas 6,25 y en las zonas sanas 6,30. Aunque dicha acidez en suelo puede estar relacionada con el hecho de que El Carmen es una zona lluviosa (media de 2.750 mm) y a la penetración de bases debido a la disolución de estas sustancias o su lixiviación en proporciones significativas, otra razón por la que estos suelos pueden ser ácidos es que los cultivos no se fertilizan, lo que hace que las plantas absorban las bases del suelo y aumenten la concentración de iones de hidrógeno, por ende, el suelo se vuelve ácido (Gobierno Autónomo Descentralizado Municipal de El Carmen, 2015), se considera que el uso continuo de fertilizantes minerales disminuye el pH del suelo y esta disminución puede alterar la microbiota y las actividades microbianas en el suelo (Adamtey et al., 2016; Ngeno et al., 2022). En estudios realizados por Li et al. (2017), se ha demostrado que existe una acidificación significativa en los suelos que contienen al patógeno, es decir, que los suelos con tendencia a ser ácidos, aumentan las poblaciones microbianas del suelo, particularmente de R. solanacearum (Ngeno et al., 2022), pero con un pH de 5,8 no se logró encontrar la presencia del patógeno en el suelo, o al menos así lo describen Bautista-Montealegre et al. (2016) en su estudio.

Tabla 3

Table 3. Chemical soil analysis of plantain farms with and without the presence of R. solanacearum.

La materia orgánica es considerada un indicador de la salud del suelo por su impacto positivo, como se ve descrito en el Plan de desarrollo y ordenamiento territorial (Gobierno Autónomo Descentralizado Municipal de El Carmen, 2015). Este plan indica que el 88,31 % del suelo en el cantón El Carmen tiene un contenido de materia orgánica en suelo de nivel medio, que según Cartagena Ayala (2002) oscilan entre el 3 y el 5%. En su estudio, Cartagena Ayala (2002) menciona que la materia orgánica es la fuente principal de algunos elementos como nitrógeno, fósforo y azufre. En las fincas que se realizaron los análisis, se obtuvieron los mismos resultados, es decir, un nivel medio de materia orgánica, para las fincas con presencia de la bacteria como para su control. Sin embargo, existen estudios mucho más amplios respecto al tema que han descrito que las fincas sanas tienen una mayor cantidad de materia orgánica (Bautista-Montealegre et al., 2016). Otros autores han mencionado la correlación positiva entre el porcentaje de materia orgánica en suelo y la abundancia de la bacteria R. solanacearum (Wang et al., 2022). Yadessa et al. (2010) demostró en un estudio que la mejora de las características fisicoquímicas del suelo, como la materia orgánica, posiblemente tengan efectos negativos en el patógeno, este aumento de materia orgánica puede desempeñar un papel importante en la minimización del daño infligido a la planta por R. solanacearum.

Por otro lado, al analizar los resultados de la Tabla 4, los factores que afectan el crecimiento de la bacteria en ambiente in vitro se observó a la bacteria ante los cambios de temperatura y la concentración de pH. Se logró observar que, según los resultados obtenidos para los rangos expuestos en esta investigación, la temperatura a la que mejor se adaptó el patógeno fue de 37 °C, con un pH promedio de 6,5; mientras que la menos favorable fue la temperatura de 4 °C y el pH promedio de 4,5 con una probabilidad de 6.796e^-10 ante la prueba de Chi².

Tabla 4

Table 4. Effects of pH level and temperature on the bacteria growth (UFC/ml).

Con ello se confirma lo mencionado por quienes argumentan que la R. solanacearum no crece por debajo de un umbral de pH de 4,4 (Li et al., 2017), mientras Bhanwar (2022), indica, que los pH de entre 5 a 7 son los mejores para el crecimiento de la bacteria. En cuanto a la temperatura, se logró observar una alta relación entre esta y el patógeno (Goszczynska et al., 2000), relación que ya se ha visto comprobada anteriormente en estudios realizados sobre el tema que indican que las poblaciones bacterianas disminuyen rápidamente en temperaturas bajo los 4 °C (Bhanwar, 2022), mientras que el rango en el que se ve un mejor crecimiento empieza desde los 20 °C siendo la temperatura óptima entre los 30 y 35 °C, con un máximo de 41 °C en el que ya no se observa crecimiento (Bhanwar, 2022; Champoiseau et al., 2009).