1. Introducción

El mal seco es la enfermedad más destructiva del quequisque (Xanthosoma spp.) a escala mundial (Saborío et al., 2004), puede causar pérdidas de 70-80 % del rendimiento (Folgueras Montiel et al., 2015) o totales (Acebedo Rivera y Navarro Matute, 2010; Saborío et al., 2004). Los síntomas son crecimiento lento, clorosis y necrosis de las hojas más viejas, las hojas jóvenes presentan color verde pálido y en casos severos las hojas se doblan en forma de arco y hay reducción o eliminación del sistema radicular (Reyes Castro, 2006; Reyes Castro et al., 2013). El patógeno persiste en el suelo por muchos años y una vez que los suelos están infestados no pueden ser cultivados de nuevo, por la sobrevivencia del agente causal en el suelo (Saborío et al., 2004).

En Nicaragua, el mal seco está presente en las zonas de producción para exportación (Nueva Guinea, El Rama, Río San Juan) y en zonas no tradicionales de la Región Central en la frontera agrícola del trópico húmedo, donde se obtienen buenos rendimientos por no más de dos ciclos seguidos; por lo que los agricultores abandonan el área para continuar la producción en suelos libres de la enfermedad, lo que encarece la producción y contamina los suelos libres del patógeno (Saavedra y Reyes, 2012).

Diferentes patógenos se han reportado asociados al mal seco: Rhizoctonia, Pythium, Erwinia y Pseudomonas (Giacometti y León, 1994), Sclerotium rolfsii (Bejarano-Mendoza et al., 1998); Fusarium spp. (Saborío et al., 2004) y un complejo de hongos en Cuba (Folgueras Montiel et al., 2015). Otros estudios reportan Pythium myriotylum Dreschler como único agente causal de la enfermedad (Nzietchueng, 1984; Pacumbaba et al., 1992; Perneel et al., 2006, Tambong et al., 1999).

En Nicaragua se aisló P. myriotylum de cortes de raíces que presentaban síntomas recientes de la enfermedad, en el medio de cultivo agar con harina de maíz más los antibióticos pimaricina, ampicilina y rifampicina (Rodríguez Zamora y Ramírez Reynoza, 2012). Otros autores aislaron el patógeno de raíces que presentaban secciones manchadas o necróticas en medio de cultivo agar agua más antibiótico (estreptomicina) (Olorunleke et al., 2014; Perneel et al., 2006; Tambong et al., 1999).

La metodología utilizada en Nicaragua, en el aislamiento de P. myriotylum, requiere de muestras de tejido fresco con lesiones recientes. Los laboratorios de fitopatología se encuentran ubicados a más de 250 km de las zonas productoras de quequisque, por lo que se dificulta la obtención de muestras de raíces frescas y se utiliza el medio PDA sin antibióticos, lo que provoca el crecimiento de diferentes hongos que pueden inhibir el crecimiento de P. myriotylum, dificultando de esta forma la obtención de un aislado puro para realizar pruebas de patogenicidad y otros estudios. Esto conlleva buscar métodos más prácticos y medios de cultivos selectivos en la captura de P. myriotylum, a partir de suelo infestado, sin necesidad de que la planta esté viva. Ciertos estudios reportan la utilización de cebos de diferentes partes de plantas en la captura de oomicetes a partir de suelo con cebos de pétalos de clavel (Dianthus caryophyllus L.) y cebos de frutos de chiltoma (Capsicum annum L.) (Sinobas et al.,1999; Urrutia-Anaya y Pacheco-Aguilar, 2009).

Este estudio tuvo el fin de evaluar métodos de aislamiento de Pythium myriotylum en quequisque lila (Xanthosoma violaceum) y otros microorganismos asociados al mal seco y realizar una prueba de patogenicidad para verificar al agente causal de la enfermedad.

2. Materiales y Métodos

2.1. Recolección de muestras

Se recolectaron cinco plantas de quequisque de cuatro meses con síntomas de la enfermedad mal seco (plantas con clorosis y necrosis en las hojas más viejas) y 2 kg de suelo circundante por punto de muestreo (dos puntos), de una plantación comercial de quequisque con antecedentes de mal seco en Nueva Guinea, Región Autónoma Costa Caribe Sur, Nicaragua (11°42'39.3" N 84°26'46.2" O). Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Micología de la Universidad Nacional Agraria [UNA] en Nicaragua. Se aislaron los patógenos relacionados con el mal seco y se registraron las características morfométricas de los hongos y las bacterias.

2.2. Aislamientos de patógenos asociados al mal seco

Para el aislamiento de los patógenos asociados con el mal seco se utilizaron tres métodos en tres medios de cultivos (Tabla 1). Se emplearon 10 platos Petri para cada método y medio de cultivo.

Los métodos de aislamiento se describen a continuación:

• Diluciones seriadas de suelo [DS]. De las muestras de suelo colectadas se tomaron 10 g de suelo de cada muestra y se diluyeron en 90 mL de agua destilada estéril; la mezcla se agitó y se realizaron diluciones seriadas descritas por Germida y de Freitas (2008) y Martínez Francés et al. (2009). De las series 10^-3 y 10^-4 se tomaron 200 µL y se depositaron en cinco platos Petri por cada medio de cultivo evaluado (Tabla 1).

• A partir de raíces con síntomas de mal seco [RS]. Se cortaron raíces jóvenes de 0,5 cm de largo que mostraban pequeñas manchas necróticas. Se lavaron con agua destilada estéril, se pasaron por hipoclorito de sodio (NaCl₃) al 1 % durante dos minutos y se realizó un enjuague con agua destilada estéril, luego fueron colocados en los platos Petri para su crecimiento (Tabla 1).

• A partir de suelo con hojas de quequisque como cebo [HQC]. Se utilizó la metodología de Almaraz-Sánchez et al. (2012) y Charlemagne y Xu (1997) modificadas, se esterilizaron trozos de hojas sanas de quequisque, aproximadamente de 0,2 cm², y se colocaron en un horno durante 72 h a 60 °C y 15 min bajo luz ultravioleta. En un beaker se diluyeron 100 g de muestra de suelo por agitación en 300 mL de agua estéril. Se eliminaron raíces y materia orgánica flotante, posteriormente se dejaron reposar por 10 min. Se colocaron los trozos de hojas estériles y se incubaron por 72 h a 28 °C (Perneel et al., 2006). Se extrajeron los cebos de la solución de suelo, se lavaron con agua estéril, se secaron en papel filtro y se colocaron en cinco platos Petri por cada medio de cultivo (Tabla 1).

2.3. Identificación, caracterización y preparación de inóculos de microorganismos aislados

Se realizó la identificación y caracterización de los microorganismos aislados que se han reportado asociados al mal seco (Nzietchueng, 1984; Pacumbaba et al., 1992; Perneel et al., 2006, Saborío et al., 2004; Tambong et al., 1999).

2.3.1. P. myriotylum

La identificación se basó en las características morfológicas del oomicete descritas por Ali-Shtayeh (1986), Plaats-Niterink (1981) y Waterhouse y Waterston (1966). Se consideró la cantidad y diámetro de los oogonios, número de anteridios por oogonio, tipo de hifas y crecimiento micelial.

Los aislados de P. myriotylum que presentaron mayor crecimiento micelial y más caracteres morfológicos, se inocularon en el medio de cultivo donde se presentó el mejor crecimiento (V8-PARB) y se incubaron a 28 °C durante cinco días, después de este período, el micelio se mezcló con agua destilada estéril en un agitador durante dos minutos. Se ajustó la suspensión a la concentración 1 x 10. oogonios mL^-1 con base en la metodología de Djeugap et al. (2016).

2.3.2. Fusarium solani

Se observó el crecimiento de Fusarium en tres medios de cultivo, y del medio donde tuvo mejor desarrollo fueron seleccionados los aislados para observar y describir las características morfométricas e identificar la especie como F. solani, según metodología de Seifert (1996) y Hafizi et al. (2013). Se consideró el color y pigmentación de la colonia, rango de crecimiento, morfología de las macroconidias y número de septos.

Antes de realizar la inoculación de F. solani aislado en plantas de quequisque, se comprobó su patogenicidad en plantas de melón con 15 días de desarrollo, después de la siembra en macetas. El inóculo se preparó en una suspensión madre y se aplicó 1 mL de esta suspensión en plántulas de melón, se realizaron dos huecos de 2 cm en el sustrato, al lado de la planta, de tal manera que las raíces quedaran descubiertas y se aplicaron 0,5 mL de la suspensión madre en cada hoyo.

El inóculo se preparó a partir de platos Petri que contenían F. solani con siete días de crecimiento en medio de cultivo PDA. Se le agregaron 20 mL de agua destilada estéril y se filtró a través de una gaza estéril a un beaker con 75 mL de agua destilada estéril y se agitó en un vórtex por un minuto. El recuento de conidias se realizó al agregar una gota de Tween 80 al 0,03 % a la suspensión y se realizaron diluciones seriadas 10^-1 y 10^-2. Se tomaron 50 µL de la última dilución para hacer el recuento con un hemocitómetro en un microscopio con visor 40X. La cantidad de conidias se ajustó según Corrales Ramírez et al. (2012) a una concentración de 1 x 10. esporas mL^-1.

2.3.3. Aislamiento de bacterias a partir de las muestras de suelo

Se preparó una solución de 10 g de suelo y 90 mL de agua estéril, se agitaron y se realizaron cinco diluciones seriadas. Se utilizaron las series 10^-4 y 10^-5y se tomaron 0,10 mL de solución para depositarlos en platos Petri con medio tetrazolio [TZC]. El crecimiento de bacterias se observó 24 h después de la inoculación.

2.3.4. Identificación de bacterias

Se realizaron pruebas bioquímicas y tinciones para identificar las bacterias por género:

• Prueba de KOH: dos gotas de KOH al 3 % se colocaron en un porta-objetos donde se agregó una porción de la colonia de bacterias y se mezcló por dos minutos. Si al separar el asa de la mezcla se formaba una hebra viscosa, la prueba resultaba positiva y la bacteria se considera Gram negativa y si no se formaba hebra, la reacción se considera negativa y la bacteria Gram positiva.

• Prueba de oxidasa: Se empleó la metodología de Goszczynska et al. (2000). Se utilizaron las bacterias Gram negativas identificadas en la prueba de KOH. Se colocaron dos gotas de diclorhidrato de tetra metil-p-fenilendiamina al 1 % en un trozo de papel filtro (1 cm²). Con un asa estéril se agregó una porción de una colonia de bacterias jóvenes (24 h). Si al minuto la muestra se tornaba color violeta oscuro era oxidasa positiva, y si no cambiaba de color era oxidasa negativa.

• Pruebas bioquímicas: Para la identificación de la bacteria por especie, se utilizaron las bacterias seleccionadas en las pruebas de oxidasa. Con un asa estéril se tomó una pequeña cantidad de colonia bacteriana y se depositó en tubos de ensayo con manitol, sorbitol, dulcitol, lactosa, maltosa y celobiosa de manera separada. En dependencia de los azúcares en los que las bacterias resultaron positivas y negativas, se identificó el biovar en correspondencia con la descripción de Schaad et al. (2001). Después de identificar las bacterias, estas se multiplicaron mediante la técnica de estriado en el medio de cultivo sólido agar nutritivo [AN] para purificar las colonias.

La preparación de la solución para la inoculación del suelo en las macetas se realizó según la metodología empleada por Rodríguez Zamora y Ramírez Reynoza (2012). La bacteria se diluyó en agua destilada estéril y se ajustó a 6 x 108 UFC mL^-1

2.4. Pruebas de patogenicidad realizadas en invernadero

Las pruebas de patogenicidad fueron realizadas en el invernadero, según como se indica a continuación.

2.4.1. Ubicación del estudio para las pruebas de patogenicidad

El ensayo se estableció en el invernadero del Centro Nacional de Investigación Agropecuaria del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria [CNIA-INTA], Managua, localizado en las coordenadas 12°07'55.3"N 86°08'49.1"O. Durante el periodo de 11 semanas que duró el ensayo se registró una temperatura promedio entre 31,5 y 35,83 °C, máximas entre 35 y 39,3 °C y mínimas entre 28 y 32,3 °C (Figura 1).

Figura 1
Temperaturas promedio, mínimas y máximas registradas en el invernadero del Centro Nacional de Investigación Agropecuaria del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria.

Figure 1. Average, minimum and maximum temperature recorded in the greenhouse at Centro Nacional de Investigación Agropecuaria del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria.

2.4.2. Aplicación de los postulados de Koch para las pruebas de la patogenicidad

Plantas in vitro del cultivar de quequisque lila se sembraron en macetas con suelo colectado en un sitio donde hubo plantaciones comerciales de quequisque en el municipio Nueva Guinea, por ser uno de los municipios con mayor producción de quequisque en Nicaragua y poseer suelos con la clasificación Ultisoles-HC Udults (suelos en estado senil en última etapa de degradación de sus propiedades química por efecto de las lluvias de color rojizo o amarillento) de acuerdo con Instituto Nicaragüense de Estudios Territoriales [INETER] y Universidad Nacional Agraria [UNA] (2015). El suelo se esterilizó en horno a 240 °C por 72 h combinado con sustrato inerte (Kekkila) a una proporción de 3:1, de este material se utilizaron 2 kg por maceta.

2.4.3. Tratamientos utilizados

Se utilizaron 15 vitroplantas de 15 cm de altura con 100 días de aclimatadas en invernadero y con, al menos, tres hojas por tratamiento. Para evaluar las afectaciones se utilizaron tres plantas por tratamiento en cada evaluación a los 7, 21 y 35 días después de inoculadas [ddi].

Se evaluaron ocho tratamientos que corresponden con los tres patógenos aislados producto de la identificación y caracterización realizada previamente, la combinación de estos y un testigo absoluto (sin aplicación de patógeno):

• T.1: Pythium myriotylum [P].

• T.2: Fusarium solani [F].

• T.3: Ralstonia solanacearum [R].

• T.4: Pythium myriotylum + Fusarium solani [P+F].

• T.5: Pythium myriotylum + Ralstonia solanacearum [P+R].

• T.6: Fusarium solani + Ralstonia solanacearum [F+R].

• T.7: Pythium myriotylum + Fusarium solani + Ralstonia solanacearum [P+F+R].

• T.8: Testigo absoluto (sin inoculación de patógenos) [T].

Se inoculó P. myriotylum con 18,5 mL de suspensión de inóculo por maceta (Djeugap et al., 2016). Para inocular F. solani se utilizó 1 mL (1 x 10⁴ esporas mL^-1) de la suspensión por maceta (Corrales Ramírez et al., 2012); y se inoculó según metodología empleada por Rodríguez Zamora y Ramírez Reynoza (2012) se aplicaron 3 mL de la solución bacteriana por maceta.

2.4.4. Re-aislamiento de patógenos de plantas de quequisque

Las plantas que presentaron síntomas del mal seco se procesaron en laboratorio a los 35 ddi, para re-aislar el patógeno presente en las raíces y el sustrato. Se utilizaron los medios de cultivo PDA, AA + SE y V8-PARB y se evaluaron las características morfométricas para comprobar la presencia del patógeno inoculado.

2.4.5. Variables evaluadas

Para evaluar los síntomas del mal seco en las plantas se registraron variables de raíces; a continuación se describen:

• Número de raíces sanas. El conteo de las raíces que no presentaron ningún tipo de lesión que indicase síntoma de ninguna enfermedad.

• Número de raíces infectadas. El conteo de todas las raíces de plantas que presentaron necrosis, marchitamiento y descortezamiento.

• Largo de raíces. Se midieron las raíces desde el inicio del cormo de la planta hasta la punta de esta, se tomaron medidas de cinco raíces tomadas al azar.

• Incidencia de la enfermedad en raíces. Se evaluó con la ecuación [1] (Djeugap et al. 2016)

[1]

2.5. Análisis de datos

A las variables raíces sanas, número de raíces afectadas, largo de raíces se les realizó un análisis de varianza [ANDEVA] y separación de media de Fisher α = 0,05 para determinar diferencias estadísticas entre los tratamientos con el programa InfoStat versión 2018e.

3. Resultados

3.1. Aislamientos de patógenos asociados al mal seco según los métodos empleados

Se registraron 119 aislados de Pythium spp. y 61 aislados de Fusarium spp. Con el método HQC se obtuvieron 16 aislados de Fusarium spp. y siete Pythium spp en el medio PDA. En el medio AA+SE 16 aislados de Fusarium spp. y 30 de Pythium spp. y en el medio V8-PARB 33 aislados de Pythium spp. (Tabla 2).

Con el método RS se obtuvo un crecimiento de Fusarium spp. en PDA. Con el método DS crecieron 27 aislados de Fusarium spp. y 21 de Pythium spp en el medio PDA y en el medio AA+SE creció un aislado de Fusarium spp y 28 aislados de Pythium spp. No hubo crecimiento en el medio V8-PARB (Tabla 2).

En el medio de cultivo PDA, creció Fusarium spp., que presentó el característico crecimiento micelial septado, con colonias de colores entre rosado y lila, con macroconidias con curvaturas entre 3-4 septos, identificado después de siete días de sembrado. El crecimiento de Fusarium en AA+SE fue escaso y no se logró observar claramente las estructuras de reproducción, lo que dificultó identificar la especie en este medio.

En el medio de cultivo AA+SE se obtuvieron 58 aislados de Pythium spp. con un crecimiento lateral y escaso del micelio dentro del medio de cultivo. Con el método HQC, se obtuvieron 70 aislados de Pythium spp. 58,8 % del total de aislados de Pythium spp. con crecimiento micelial muy algodonoso, ascendente y abundante en el plato Petri en el medio de cultivo V8-PARB (33 aislados) en comparación con los medios de cultivo PDA (7 aislados) y AA+SE (30 aislados) y fue el único patógeno que creció en este medio.

3.2. Identificación de patógenos

Se identificó el patógeno Pythium myriotylum aislado del método HQC en el medio de cultivo V8-PARB a los tres días después de sembrado a una temperatura de 28 °C. presentó micelio ascendente de color blanco y algodonoso con gran cantidad de oogonios de 23 µm de diámetro, de forma redonda con doble pared y de 1 a 3 anteridios por oogonio, con abundantes oosporas con hifas cenocíticas, desarrollo de esporangios filamentosos (Figura 2). Todos los aislados de P. myriotylum virulentos de quequisque crecen mejor a 28 °C (Perneel et al., 2006). No se logró identificar la especie P. myriotylum en los otros medios debido a la carencia de estructuras reproductivas y poco desarrollo del micelio.

Figura 2
Estructuras de P. myriotylum observadas bajo el microscopio a 40X e identificadas mediante claves taxonómicas a) Crecimiento de P. myriotylum en medio de cultivo jugo V8 con pimaricina, ampicilina, rifampicina y benomil, b) oogonios, c) hifas cenocíticas y esporangios.

Figure 2. Pythium myriotylum structures observed under the microscope 40X and identified by taxonomic keys a) Growth of Pythium myriotylum in culture medium V8 with Pimaricin, Ampicilin, Rifampicin and Benomil medium b) Oogonia c) Coenocytic hyphae and sporangia.

Fusarium solani se aisló e identificó con el método DS en el medio de cultivo PDA. Presentó micelio aéreo y textura algodonosa de colores entre blanco grisáceo y rosado con pigmentaciones de colores entre lila, púrpura y marrón, hifas septadas y cantidades abundantes de microconidias con 3-4 septos, como las descritas por Seifert (1996), Rodríguez Zamora y Ramírez Reynoza (2012), y Hafizi et al. (2013) (Figura 3). No se logró identificar la especie en los aislados de PDA de los métodos RS y HQC por presentarse poco micelio (Tabla 2).

Figura 3
a) Crecimiento de F. solani en medio de cultivo PDA a los ocho días de sembrado en medio, b) Identificación morfológica de F. solani, hifas y macroconidias.

Figure 3. a) Growth of F. solani in PDA culture medium eight days after inoculation in medium, b) Morphological identification of F. solani, hyphae and macroconidia.

Se identificó a Ralstonia solanacearum biovar 2, después de realizar las pruebas KOH, oxidasa y bioquímicas, resultaron positivos los azúcares maltosa, celobiosa y lactosa, que corresponde a la bacteria R. solanacearum, según la descripción de Schaad et al. (2001).

3.3. Pruebas de patogenicidad con base en los postulados de Koch

En las pruebas de patogenicidad, los tratamientos combinados con P. myriotylum mostraron síntomas de afectación en las raíces. A continuación, se muestran en cada una de las variables:

• Las plantas evaluadas mostraron valores promedios de raíces sanas en rangos de 4,7-20,7 con longitudes de 5,7-24,8 cm, y con un rango promedio de 0-11 raíces afectadas. Se registraron diferencias significativas entre los tratamientos en todas las variables y todas las evaluaciones, con excepción del largo de raíces a los 35 ddi (Tabla 3).

• El número de raíces afectadas, en los tratamientos R, F, F+R y T, registraron la misma categoría en todas las evaluaciones, y se observaron plantas con raíces sin ninguna afectación (Tabla 3).

• Los tratamientos P+R, P, P+F+R y P+F se ubicaron en la segunda categoría, con raíces necróticas, pudrición, lesiones y descortezamiento en las mismas, síntomas característicos del mal seco. Estas afectaciones se atribuyen a un patógeno común en estos tratamientos: P. myriotylum (Tabla 3).

Las plantas de los tratamientos F, R, F+R y T tuvieron un crecimiento normal y el porcentaje de incidencia de la enfermedad en las raíces fue menor al 10 por ciento en todas las evaluaciones. Por otra parte, las raíces de las plantas de los tratamientos P, P+F, P+R y P+F+R mostraron un aumento de la incidencia de la enfermedad al pasar los 7 días después de haber sido inoculadas, con síntomas de necrosis y marchitamiento en las raíces (Figura 4).

Figura 4
Porcentaje de incidencia de la enfermedad en las raíces de plantas in vitro del cultivar quequisque lila (Xanthosoma violaceum), inoculado con aislados patogénicos P. myriotylum [P], F. solani [F], R. solanacearum [R] aplicados solos y en combinación (P+F, P+R, F+R, P+F+R) y testigo [T] sin inoculación de patógenos.

Figure 4. Percentage of dissease incidence regisgered in the roots of in vitro plants of the cultivar quequisque Lila (Xanthosoma violaceum), inoculated with pathogenic isolates P. myriotylum [P], F. solani [F], R. solanacearum [R] applied alone and in combination (P + F, P + R, F + R, P + F + R) and control [T] without pathogen inoculation.

3.4. Re-aislamiento de patógenos de plantas de quequisque con síntomas de mal seco

Los patógenos aislados de las plantas con síntomas de mal seco fueron los mismos patógenos inoculados en la prueba de patogenicidad, cumpliéndose con el postulado número 4 de Koch, según Agrios (2005) (Tabla 4).

Pythium myriotylum fue aislado de todos los tratamientos (P, P+F, P+R y P+F+R) en dos medios de cultivos AA+SE y V8+PARB (Tabla 4).

4. Discusión

El empleo del método de captura HQC en combinación con el medio de cultivo V8+PARB resultó ser el más efectivo para el aislamiento y crecimiento de Pythium myriotylum. Al estar P. myriotylum en un medio acuoso y al entrar en contacto con las hojas se crearon las condiciones para su germinación y desarrollo, lo que facilitó su aislamiento, al encontrarse mayor cantidad de micelio en los trozos de hojas. La humedad del suelo puede afectar la producción de esporangios, desarrollo de anteridios, oogonios y desarrollo de micelio de Pythium (Yudiarti et al., 2006). Esta combinación de técnicas garantiza tener aislados de P. myriotylum sin necesidad de utilizar plantas de quequisque con afectaciones recientes del mal seco. A menudo el aislamiento debe realizarse de tejido muy deteriorado que puede contener propágulos inactivos de Pythium por lo que es preferible que el medio permita que las esporas germinen y se desarrollen más fácilmente (Jeffers y Martin, 1986).

Otros autores aislaron Pythium con tejido trampa de chiltoma (Capsicum annuum L.), en suelo humedecido a saturación y medio de cultivo agar harina de maíz y jugo V8 suplementados con los antibióticos pimaricina, vancomicina y pentanitroclorobenceno; y obtuvieron crecimiento micelial abundante, que saturó la caja Petri en el medio de cultivo V8, lo que facilitó la identificación y manipulación de este (Urrutia-Anaya y Pacheco-Aguilar, 2009), este mismo crecimiento se presentó en este estudio en el medio de cultivo V8+PARB, lo que facilitó la identificación de P. myriotylum en comparación con los otros medios utilizados (AA+SE y PDA), donde el crecimiento fue escaso y no se presentaron estructuras de reproducción para poder realizar la identificación de la especie, por lo que solo fue posible llegar hasta nivel de género en los aislados encontrados en estos medios.

Contar con un medio de cultivo donde se desarrolle P. myriotylum es de gran importancia para facilitar su identificación. El medio de jugo V8 con diferentes antibióticos se utilizó anteriormente y se demostró la importancia del uso de antibióticos en medios de cultivos selectivos para el crecimiento y desarrollo del patógeno (Jeffers y Martin, 1986; Rodríguez Zamora y Ramírez Reynoza, 2012; Urrutia-Anaya y Pacheco-Aguilar, 2009). El uso de antibióticos (pimaricina, ampicilina y rifampicina) y fungicidas (benomil) en el medio de cultivo V8+PARB inhibió el crecimiento de bacterias y hongos que están presentes en el suelo, lo que permitió un desarrollo exuberante de P. myriotylum, lográndose observar estructuras reproductivas que facilitaron su identificación. En los medios AA+SE y PDA crecieron otros hongos y bacterias que en algunos casos saturaron los medios de cultivos y no era posible realizar la identificación de las especies presentes en el medio. A pesar de que Pythium spp. produce profusamente sus estructuras en el suelo, es difícil recuperarlo en el medio, debido a que Pythium crece menos que otros hongos o bacterias, por lo tanto se requiere una técnica especial (Yudiarti et al., 2006)

Los aislados de P. myriotylum que infectan a quequisque son diferentes del aislado típico de P. myriotylum que causa damping off en otras plantas hospederas y pueden ser distinguidos de otros aislados de P. myriotylum por su temperatura óptima de crecimiento en laboratorio (28 °C) (Perneel et al., 2006) utilizada en este estudio en el aislamiento y multiplicación del oomicete. Para el aislamiento e identificación de Pythium son necesarios medios que permitan estimular la formación de las estructuras como esporangios, oogonios y anteridios para poder identificarlo, ya que en Pythium la morfología de los esporangios es clave para su identificación (Urrutia-Anaya y Pacheco-Aguilar, 2009).

Las dificultades del aislamiento de P. myriotylum a partir de raíces (visibilidad de los primeros síntomas en raíces y medios de cultivos específicos) podrían explicar las diferencias en la definición del agente causal de mal seco en quequisque. Algunos autores atribuyen a F: solani, Sclerotium rolsii Sacc y un complejo de hongos los síntomas de mal seco (Dávila Martínez, 2011; Dávila Martínez et al., 2016; Folgueras Montiel et al., 2015; Saborío et al., 2004). En las variables incidencia de la enfermedad en raíces y número de raíces afectadas (Tabla 3 y Figura 3) P. myriotylum está presente en los tratamientos que muestran plantas con síntomas de mal seco, como necrosis y marchitamiento en las raíces, lo que comprueba los resultados de Nzietchueng (1984); Pacumbaba et al. (1992); Tambong et al. (1999), y en Nicaragua Rodríguez Zamora y Ramírez Reynoza (2012), quienes presentan a P. myriotylum como el único agente causal de mal seco en quequisque.

5. Conclusiones

El método de aislamiento de Pythium myriotylum, a partir de suelo con hojas de quequisque como tejido trampa, resultó ser efectivo. Al combinar este método con el medio de cultivo jugo V8 más pimaricina, ampicilina, rifampicina y benomil, se obtuvo mayor cantidad de aislados de P. myriotylum con micelio abundante que facilitaron su identificación morfométrica. P. myriotylum provocó síntomas característicos de mal seco en las vitroplantas de quequisque lila. Las plantas inoculadas con F. solani y R. solanacearum solos o combinados no presentaron síntomas de mal seco.

Contribuciones de los autores

• Heeidy Guadalupe Corea Narváez: conceptualización, análisis formal, investigación, metodología, redacción - borrador original.

• Rayan Oniel Gonzalez Moya: investigación, metodología.

• Guillermo del Carmen Reyes Castro: conceptualización, adquisición de fondos, administración del proyecto, recursos, supervisión.

Implicaciones éticas

Los autores declaran que no existen implicaciones éticas.

Conflicto de interés

Los autores declaran que no existen conflictos de interés financieros o no financieros que podrían haber influido en el trabajo presentado en este artículo.

Referencias

Acebedo Rivera, J. A., y Navarro Matute, E. R. (2010). Efectos del mal seco (Phytium myriotylum Drechs. en campo y sombreadero sobre la agromorfología de 15 accesiones de quequisque (Xanthosoma spp.), desarrollo de síntomas y detección microbiológica. Universidad Nacional Agraria. https://repositorio.una.edu.ni/id/eprint/2120

Agrios, G. N. (2005). Fitopatología (2. ed.). Limusa S.A.

Ali-Shtayeh, M. S. (1986). The genus pythium in the west bank and Gaza Strip. Research and Documentation Centre, An-Najah National University. https://staff-old.najah.edu/msshtayeh/published-book/genus-pythium-west-bank-and-gaza-strip

Almaraz-Sánchez, A., Alvarado-Rosales, D., y Saavedra-Romero, L. de L. (2012). Trampeo de Phytophthora cinnamomi en bosque de encino con dos especies ornamentales e inducción de su esporulación. Revista Chapingo Serie Ciencias Forestales y del Ambiente, 19(1), 5-12. www.doi.org/10.5154/r.rchscfa.2011.09.062

Bejarano-Mendoza, C. A., Zapata, M., Bosques, A., Rivera-Amador, E., y Liu, L. J. (1998). Sclerotium rolfsii como componente del complejo patológico causante del mal seco de la yautía (Xanthosoma sagittifolium). The Journal of Agriculture of the University of Puerto Rico, 82(1-2), 85-95. https://doi.org/10.46429/jaupr.v82i1-2.3822

Cañedo, V., y Ames, T. (2004). Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatógenos. Centro Internacional de la Papa. https://cipotato.org/wp-content/uploads/2014/09/AN65216.pdf

Charlemagne, T. T. J., y Xu, T. (1997). Pythium species from cocoyam farm soils in Cameroon. Fungal Science, 12(1/2), 9-15.

Corrales Ramírez, L. C., Sánchez Leal, L. C., Cuervo Andrade, J. L., Joya, J. A., y Márquez, K. (2012). Efecto biocontrolador de Bacillus spp., frente a Fusarium sp., bajo condiciones de invernadero en plantas de tomillo (Thymus vulgaris l.). Revista Nova Publicación Científica en Ciencias Biomédicas, 10(17), 64-82. https://doi.org/10.22490/24629448.518

Dávila Martínez, A. (2011). Las pudriciones secas de la malanga (Xanthosoma y Colocasia). Etiología y sintomatología. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. https://dspace.uclv.edu.cu/handle/123456789/2173

Dávila Martínez, A., Herrera Isla, L., Folgueras Montiel, M., y Espinosa-Cuellar, E. (2016). Patogenicidad de especies fúngicas presentes en los rizomas de malanga (Xanthosoma y Colocasia). Centro Agrícola, 43(2), 49-58. http://cagricola.uclv.edu.cu/descargas/pdf/V43-Numero_2/cag07216.pdf

Djeugap, F. J., Azia, A. T., Tita, N. C., Eko, D., y Fontem, D. A. (2016). Influence of compost types and fungicide application on plant growth and suppressiveness of cocoyam [Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott] root rot disease. International Journal of Agriculture and Bioscience, 5(1), 32-37. https://www.ijagbio.com/pdf-files/volume-5-no-1-2016/32-37.pdf

Folgueras Montiel, M., Herrera Isla, L., y Rodríguez Morales, S. (2015). El mal seco de la malanga (Xanthosoma y Colocasia) en Cuba. Revista Agricultura Tropical, 1(1), 62-65.

Germida, J. J., y de Freitas, J. R. (2008). Cultural methods for soil and root associated microorganisms. En M. R. Carter, y E. G. Gregorich (eds.), Soil sampling and methods of analysis (2nd ed.). CRC Press. https://doi.org/10.1201/9781420005271

Giacometti, D. C., y Leon, J. (1994). Tannia, yautia (Xanthosoma sagittifolium). En J. E. Hernández Bermejo, y J. León (eds.), Neglected Crops: 1492 from a different perspective (pp. 253-258). FAO Plant Production and Protection Series No.26. Food and Agriculture Organization of the United Nations. https://www.fao.org/4/t0646e/t0646e.pdf

Gómez-Alpízar, L., Saalau, E., Picado, I., Tambong, J. T., y Saborío, F. (2011). A PCR-RFLP assay for identification and detection of Pythium myriotylum, causal agent of the cocoyam root rot disease. Letters in Applied Microbiology, 52(3), 185-192. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2010.02998.x

Goszczynska, T., Serfontein, J. J., y Serfontein, S. (comps.). (2000). Introduction to practical phytobacteriology: A manual for phytobacteriology (1st ed.). Safrinet-Loop of bioNet-International. https://ipmil.cired.vt.edu/wp-content/uploads/2014/06/Practical-Bacteriology-Guide-copy.pdf

Hafizi, R., Salleh, B., y Latiffah, Z. (2013). Morphological and molecular characterization of Fusarium solani and F. oxysporum associated with crown disease of oil palm. Brazilian Journal of Microbiology, 44(3), 959-968. https://doi.org/10.1590/S1517-83822013000300047

Instituto Nicaragüense de Estudios Territoriales [INETER], y Universidad Nacional Agraria [UNA]. (2015). Mapa de suelos de la República de Nicaragua. INETER.

Jeffers, S. N., y Martin, S. B. (1986). Comparison of two media selective for Phytophthora and Pythium species. Plant Disease, 70(11), 1038-1043. https://doi.org/10.1094/PD-70-1038

Martínez Francés, M. Á., Lacasa Plasencia, A., y Tello Marquina, J. C. (2009). Ecología de la microbiota fúngica de los suelos de los invernaderos de pimiento y su interés agronómico. Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino. https://www.mapa.gob.es/es/agricultura/publicaciones/ECOLOGIA%20MICROBIOTA%20baja_tcm30-57876.pdf

Nyochembeng, L. M., Pacumbaba, R. P., y Beyl, C. A. (2002). Calcium enhanced zoospore production of Pythium myriotylum in vitro. Journal of Phytopathology, 150(7), 396-398. https://doi.org/10.1046/j.1439-0434.2002.00759.x

Nzietchueng, S. (1984). Root rot Xanthosoma sagittifolium caused by Pythium myriotylum in Camerun. En E. R. Terry, E. V. Doku, O. B. Arene, y N. M. Mahungu (eds.), Tropical root crops: production and uses in Africa. Proceedings of the second triennial Symposium of the international society of tropical Root crops (pp. 185-188). International Development Research Centre. https://idl-bnc-idrc.dspacedirect.org/server/api/core/bitstreams/5598eb2e-0462-4abe-a928-38e051112bbb/content

Olorunleke, F., Adiobo, A., Onyeka, J. T., y Höfte, M. (2014). Cocoyam root rot disease caused by Pythium myriotylum in Nigeria. En Tropentag 2014: Conference on International Research -on Food Security, Natural Resource Management and Rural Development. Praga, República Checa. https://www.tropentag.de/2014/abstracts/links/Houmlfte_5jvOBYj9.pdf

Pacumbaba, R. P., Wutoh, J. G., Eyango, S. A., Tambong, J. T., y Nyochembeng, L. M. (1992). Isolation and pathogenicity of rhizosphere fungi of cocoyam in relation to cocoyam root rot disease. Journal of Phytopathology, 135(4), 265-273. https://doi.org/10.1111/j.1439-0434.1992.tb04312.x

Perneel, M., Tambong, J. T., Adiobo, A., Floren, C., Saborío, F., Lévesque, A., y Höfte, M. (2006). Intraspecific variability of Pythium myriotylum isolated from cocoyam and other host crops. Mycological Research, 110(5), 583-593. https://doi.org/10.1016/j.mycres.2005.12.002

Plaats-Niterink, J. van der. (1981). Monograph of the genus Pythium. Studies in Mycology, (21). https://www.studiesinmycology.org/sim/Sim21/full%20text.htm

Reyes Castro, G. (2006). Studies on cocoyam (Xanthosoma spp.) in Nicaragua, with emphasis on Dasheen mosaic virus. Swedish University of Agricultural Sciences. https://res.slu.se/id/publ/13224

Reyes Castro, G. del C., Corea Narváez, H. G., y Guatemala Ortega, T. (2013). Guía del manejo agronómico del quequisque en Nicaragua. Programa Propemce. https://cenida.una.edu.ni/relectronicos/RENF01R457g.pdf

Rodríguez Zamora, M. J., y Ramírez Reynoza, D. J. (2012). Diagnóstico de los agentes causales del mal seco en el cultivo de quequisque (Xanthosoma spp.) en el municipio de Nueva Guinea, Nicaragua. https://repositorio.una.edu.ni/2161/

Saavedra, D., y Reyes, G. (2012). Prospección tecnológica para el manejo de mal seco en quequisque. FUNICA.

Saborío, F., Umaña, G., Solano, W., Amador, P., Munos, G., Valerin, A. T., Torrez, S., y Valverde, R. (2004). Induction of genetic variation in Xanthosoma spp. En International Atomic Energy Agency, Genetic improvement of under-utilized and neglected crops in low income food deficit countries through irradiation and related techniques (pp. 143-154). International Atomic Energy Agency. https://www.iaea.org/publications/7155/genetic-improvement-of-under-utilized-and-neglected-crops-in-low-income-food-deficit-countries-through-irradiation-and-related-techniques

Schaad, N. W., Jones, J. B., y Chun, W. (2001). Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria (3rd ed.). American Phytopathological Society Press. https://doi.org/10.1046/j.1365-3059.2001.00635.x

Seifert, K. (1996). Fuskey: Fusarium interactive key, taxonomic information systems. Agriculture & Agri-Food Canada. https://www.pilzforum.eu/attachment/433750-fusarium-key-pdf/

Sinobas, J., Varés, J., y Rodríguez, E. (1999). Influencia del tipo de «cebo» y la temperatura en el aislamiento y desarrollo de Pythium spp. Boletín de Sanidad Vegetal, Plagas, 25(2), 131-142. https://www.mapa.gob.es/app/publicaciones/art_datos_art.asp?articuloid=836&codrevista=Plagas

Steiner, K. G. (1981). A root rot of macabo (Xanthosomasp.) in Cameroun, associated with Pythium myriotylum. Journal of Plant Diseases and Protection, 88(10), 608-613. https://www.jstor.org/stable/43216229

Tambong, J. T., Poppe, J., y Höfte, M. (1999). Pathogenicity, electrophoretic characterization and in planta detection of the cocoyam root rot disease pathogen, Pythium myriotylum. European Journal of Plant Pathology, 105, 597-607. https://doi.org/10.1023/A:1008745732733

Waterhouse, G. M., y Waterston, J. M. (1966). Pythium myriotylum . [Descriptions of Fungi and Bacteria]. Descriptions of Fungi and Bacteria. https://doi.org/10.1079/DFB/20056400118

Urrutia-Anaya, I., y Pacheco-Aguilar, J. R. (2009). Aislamiento e identificación de Pythium sp., un fitopatógeno de interés agrícola en el estado de Querétaro. Universidad Autónoma de Querétaro. https://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-2009/11VCRC_46/35_Urrutia_Anaya_Color.pdf

Yudiarti, T., Jensen, D. F., y Hockenhull, J. (2006). Isolation and identification of Pythium from soil. Jurnal Pengembangan Peternakan Tropis, 3(31), 141-146. http://eprints.undip.ac.id/6894/

Notas de autor

hcorea@ci.una.edu.ni

Información adicional

e-location: e6796