1. Introducción

La ganadería en Guaranda no solo impulsa la economía local, sino que también contribuye al suministro de productos cárnicos y lácteos a nivel regional y nacional. Sin embargo, la presencia de enfermedades, como la brucelosis, puede afectar significativamente la productividad y sostenibilidad del sector ganadero. La brucelosis es una patología infectocontagiosa del ganado con notables repercusiones económicas, y se ha convertido en un desafío crucial para la ganadería.

Causada por diversas bacterias del género Brucella, la enfermedad afecta a una amplia variedad de especies animales, siendo el bovino el principal, y en ocasiones al ser humano a través de leche no tratada o pasteurizada incorrectamente, sus productos derivados o el contacto con secreciones vaginales del aparato reproductor del animal durante el manejo (World Organisation for Animal Health, 2022).

La identificación de Brucella incluye la serología, que busca detectar anticuerpos específicos, el cultivo microbiológico, que se constituye en la prueba Gold Standard llegando al aislamiento de la bacteria y la identificación molecular que es un procedimiento rápido que no requiere el cultivo de la bacteria y minimiza el riesgo de contaminación en el laboratorio, a través de este procedimiento se detectan secuencias específicas y se estable diferencias entre especies. Esta investigación se enfoca en identificar molecularmente Brucella y determinar las diferentes biovariedades circulantes en las ganaderías del cantón Guaranda.

Con una población de 26.327 vacas en edad reproductiva, el establecimiento de buenas prácticas en ganadería bovina en este cantón es un componente esencial para la seguridad alimentaria y la economía local (Agrocalidad, 2023). La etiología de la brucelosis, causada por diferentes especies de Brucella como abortus, melitensis, suis, etc., se manifiesta principalmente con abortos y problemas reproductivos en los animales, generando pérdidas económicas considerables para los productores de ganado (World Organisation for Animal Health, 2022). La información recabada contribuye a la comprensión de la distribución de la brucelosis y proporciona datos valiosos para estrategias de control y prevención, asegurando el bienestar del ganado, la seguridad alimentaria y la salud pública.

2. Materiales y Métodos

2.1. Toma de muestras

Se tomaron muestras de sangre de hembras bovinas en edad reproductiva de las diferentes parroquias del cantón Guaranda: Ángel Polibio Chávez (1), Gabriel Ignacio Veintimilla (13), Guanujo (64), Facundo Vela (2), Julio Moreno (1), Salinas (44), San Lorenzo (6), San Luis de Pambil (14), San Simón (9), Santa Fé (2), Simiatug (24), dando un total de 180 muestras.

2.2. Obtención de la muestra

Para obtener la muestra se desinfectó la zona de la piel y, mediante punción en la vena coccígea, se recolectaron las muestras utilizando una aguja de doble dirección estéril y un tubo vacutainer de tapa amarilla de 5 mL. Se etiquetó con un código relacionado a la finca de procedencia, parroquia y sector, luego se guardó en un cooler con gel refrigerante hasta su procesamiento.

2.3. Obtención de suero

Las muestras de sangre se centrifugaron durante 5 minutos para obtener el suero, este se guardó en tubos Eppendorf y se conservó a -20 °C.

2.4. Prueba serológica

Una vez obtenidas todas las muestras se procedió a realizar la prueba de iELISA indirecto mediante el kit para Elisa de VETLIS CHEMTEST para detectar anticuerpos anti-Brucella. El fundamento de la prueba es la fijación de antígenos en una microplaca, seguida de la incubación con el suero bovino, que contiene anticuerpos que se unen a los antígenos. Tras un lavado, se añaden anticuerpos secundarios marcados con una enzima. La reacción con sustrato produce un cambio de color proporcional a la cantidad de anticuerpos, permitiendo la detección temprana de la infección al comparar la absorbancia con valores de referencia del kit que se miden en el lector de microplacas de ELISA, determinando así la presencia y cantidad de anticuerpos en el suero bovino y su interpretación siguiendo las recomendaciones del fabricante.

2.5. Pruebas Moleculares

Se siguió el siguiente procedimiento:

• Extracción de material genético. Para realizar la prueba molecular, se extrajo ADN (bacteriano) en sangre de los animales positivos a iELISA: 1M, 4M, 5M, 6M y 7M. También se incluyeron dos muestras adicionales (2M y 3M) provenientes de la parroquia San Lorenzo, que no fueron muestreados previamente, pero estuvieron en contacto con una vaca positiva dentro del mismo predio, se utilizó el kit para extracción de ADN PureLink™ Genomic DNA el cual lisa la pared celular de la bacteria y libera el material genético, se cuantificó en ng/uL y la pureza del ADN mediante la relación de absorvancia A280/A260, los ácidos nucleicos absorben A 260 nm y las proteínas A280 nm la relación de ADN entre 1,8 y 2 es de buena calidad, esta medición se realizó mediante un espectrofotómetro Nanodrop (DNA bacteriano).

• Amplificación mediante PCR. Las muestras fueron enviadas a Macrogen, Inc., en Seúl, Corea del Sur, donde se realizaron las PCR. Para el experimento, se sintetizaron los primers universales B4: 5'- TGGCTCGGTTGCCAATATCAA -3' y B5: 5'- CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG -3', que amplifican bandas de 223 pb (Figuras 1 y 2) y se unen a la región interna del gen BSCP31, presente en todas las especies de Brucella.

  Amplificación mediante PCR. Las muestras fueron enviadas a Macrogen, Inc., en Seúl, Corea del Sur, donde se realizaron las PCR. Para el experimento, se sintetizaron los primers universales B4: 5'- TGGCTCGGTTGCCAATATCAA -3' y B5: 5'- CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG -3', que amplifican bandas de 223 pb (Figuras 1 y 2) y se unen a la región interna del gen BSCP31, presente en todas las especies de Brucella.

  Además, se usaron los primers universales IS711: Forward: 5'-TCGCTCGTCTGAACTCGC-3' y Reverse: 5'-AATCCGGCCGTTTGCAGG-3', que amplifican bandas de 498 pb y se unen a una región específica de la secuencia de inserción IS711, presente en todo el género Brucella.

  La PCR con los primers IS711 se realizó bajo el protocolo y condiciones establecido por Macrogen, (PCR estándar + Purificación).

  La PCR con los primers B4 y B5 se realizó bajo las siguientes condiciones enviadas a Macrogen: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, anillamiento a 60 °C por 30 segundos, y extensión a 72 °C por 1 minuto. El proceso finalizó con una extensión adicional a 72 °C durante 10 minutos (PCR personalizada + Purificación).

• Secuenciación: Se secuenció los productos PCR en Macrogen, Inc.

Figura 1
Amplificación de Brucella mediante Electroforesis en gel de agarosa banda 223pb y bandas 498pb.*

Figure 1.Brucella amplification by agarose gel electrophoresis: 223bp band and 498bp bands.*

Figura 2
Amplificación de Brucella mediante Electroforesis en gel de agarosa bandas 223pb.**

Figure 2.Brucella amplification by agarose gel electrophoresis, 223 bp bands.**

2.6. Análisis filogenético

Después de la secuenciación, se recibieron los resultados y se inició el proceso de limpieza de secuencias visualizando y editando el electroferograma mediante el software Chromas versión 2,6 en donde fueron eliminados los extremos de cada primer que no forman parte del gen objetivo. Con el software BioEdit versión 7,2 se ensambló las secuencias previamente editadas en una sola secuencia consenso luego se compararon con aquellas presentes en la base de datos BLAST del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), de los Estados Unidos, buscando homologías de nucleótidos. Este análisis permitió identificar el género de la bacteria, establecer alineamientos y realizar un análisis filogenético en el programa MEGA versión 11,13 que revela las relaciones entre las diferentes biovariedades de Brucellaspp.

3. Resultados

De las 180 muestras de suero de hembras bovinas del cantón Guaranda, analizadas mediante la prueba iELISA, cinco resultaron positivas, lo que indicó una prevalencia del 2,8% de Brucella spp. Las parroquias Gabriel Ignacio Veintimilla, Guanujo, Salinas y Simiatug tuvieron una prevalencia del (0,56%) presentando un solo caso en cada una (Tabla 1).

De los animales seropositivos se extrajo ADN y su cuantificación se detalla en la Tabla 2.

De las siete muestras analizadas, todas resultaron positivas en la prueba de PCR, indicando una prevalencia del 3,8% de Brucella spp en todo el cantón. Entre las parroquias evaluadas, San Lorenzo presentó la mayor proporción de casos positivos, con el 1,6% (Figura 3). Las parroquias Gabriel Ignacio Veintimilla, Guanujo, Salinas y Simiatug tuvieron una prevalencia del 0,5% (Tabla 3).

Figura 3
Ubicación de los casos positivos en el cantón Guaranda.

Figure 3. Location of positive cases in the Guaranda canton.

Al comparar la prueba serológica y la prueba molecular para la detección de Brucella, de los cinco animales que dieron positivo en iELISA también resultaron positivos en PCR, logrando una sensibilidad y un valor predictivo positivo del 100%. Sin embargo, no se compararon las dos muestras adicionales que dieron positivo en PCR porque no se les realizó la prueba serológica (Tabla 4).

El dendrograma se obtuvo alineando las secuencias de Brucella obtenidas del cantón Guaranda y siendo comparadas con las cepas de referencia del Centro Nacional para la Información Biotecnológica [NCBI] (Figura 4).

Figura 4
Diseño del árbol filogenético.

Figure 4. Phylogenetic tree design.

Los primers universales B4 y B5 que codifican para una proteína de membra externa de Brucella abortus, mediante el secuenciamiento determinó que los casos encontrados se corresponden con Brucella abortus, lo que se confirma con la comparación con otras secuencias utilizadas y la cercanía con Brucella suis., la distancia genética 0,20 sugiere que las poblaciones tienen un ancestro común pero que han acumulado una serie de mutaciones para poder ser distinguibles

4. Discusión

La prevalencia de brucelosis en una región no es solo una cifra estadística, es un indicador crítico del desarrollo sanitario, económico y de salud de las poblaciones animales, en este estudio se encontró una prevalencia del 2,8% de Brucella spp mediante la prueba iELISA en comparación con los resultados obtenidos por Ojeda (2018) quien ha reportado porcentajes más altos, con 7,4% en Zamora Chinchipe, aunque podría haber más infectados dentro de los mismos predios de animales que no fueron muestreados, en este contexto la distribución de brucelosis es marcadamente desigual entre diferentes países y regiones, en países europeos han logrado erradicar o mantener prevalencias cercanas a 0%, en países de Latinoamérica en cambio es diferente, mientras unos con gran tecnificación del sistema productivo alcanzan los niveles más bajos otros pueden alcanzar la prevalencias entre el 10% y 30%

Para la prueba molecular las extracciones de DNA oscilaron entre 14,6 ng uL^-1 y 54,2 ng uL^-1, indicando diferentes niveles de contenido genético. Las relaciones A260/A280, las cuales van desde 1,69 hasta 1,90 indicando un grado de pureza optima. Resultados similares a los obtenidos por Ojeda (2018) que obtuvo un promedio de 1,68 y concentraciones de 18 a 60 ng uL^-1.

La persistencia de la bacteria depende de diferentes factores, entre ellos biológicos, de manejo y socioeconómicos, se destaca el ingreso de reemplazos sin el certificado de salud ingresando animales enfermos a fincas sanas, los sistemas de crianza extensivas tienen menos prevalencias que las intensivas en las que el hacinamiento facilita la trasmisión por contacto, aerosol, placentas o fluidos tras el aborto, la monta natural a través de sementales infectados perpetua la cadena de trasmisión, en este estudio se incluyeron para el análisis dos animales sospechosos con signología clínica, expuestos a un animal positivo para realizar la prueba de PCR, similar a lo que realizó Gonuguntla et al. (2023) para determinar la incidencia de nuevos casos en un mismo predio detectándose como positivos.

En la PCR para la detección de Brucella spp, los primers universales IS711 se unen al elemento de inserción IS711, específico de Brucella y presente en múltiples copias en su genoma, ofreciendo alta sensibilidad y especificidad (Aljanazreh et al., 2023). En contraste, los primers B4 y B5 amplifican una región del gen bcsp31, específica de todas las especies de Brucella, que suele estar presente en menos copias, puede resultar en una menor sensibilidad en la detección, pero son adecuados para la secuenciación (Zamanian et al., 2015). Según los resultados de este estudio, la prevalencia molecular de Brucella en el cantón Guaranda es del 3,8% utilizando ambos tipos de primers, la diferencia entre la prevalencia serológica y molecular detectada se debe a que se procedió a tomar dos muestras adicionales que se los sometieron al análisis molecular de los predios previamente identificados con animales seropositivos, confirmándose que en los predios con animales seropositivos las pruebas se deben realizar a todos los animales.

En la investigación realizada por Legesse et al. (2023) se determinaron que la PCR es más sensible que el iELISA para detección de Brucella en muestras de sangre y leche de vacas infectadas. En este estudio las pruebas moleculares realizadas en sangre dieron todas positivas lo que indica una alta sensibilidad de la PCR, confirmando los resultados de la prueba serológica.

5. Conclusiones

La evidencia epidemiología sugiere la presencia de brucelosis bovina en la zona de estudio que no deriva de una carencia de herramientas diagnósticas cuya sensibilidad y especificidad actual permite una detección fidedigna sino posiblemente a deficiencias en la gestión estratégica de los programas de control

El diagnóstico de brucelosis a través de técnicas serológicas en al actual momento se convierten en herramientas de tamizaje por el bajo costo, sin embargo, la estandarización de protocolos moleculares son herramientas indispensables para la vigilancia epidemiológica moderna por su sensibilidad analítica y su capacidad de reducir el tiempo de diagnóstico de semanas a pocas horas

Contribuciones de los autores:

• Willian Conde Castillo: conceptualización, investigación, metodología, redacción – borrador original.

• Franklin Román Cárdenas: investigación, recursos, supervisión, validación, redacción – revisión y edición.

Disponibilidad de datos

Los datos que se han utilizado son confidenciales.

Declaración de Uso de Inteligencia Artificial

Los autores declaran que no se ha utilizado Inteligencia Artificial en la elaboración del manuscrito.

Implicaciones éticas

Los autores declaran que no existen implicaciones éticas.

Conflicto de interés

Los autores declaran que no existen conflictos de interés financieros o no financieros que podría haber influido en el trabajo presentado en este artículo.

Referencias

Agrocalidad. (2023). Buenas prácticas pecuarias en la producción de carne.

Aljanazreh, B., Shamseye, A. A., Abuawad, A., y Ashhab, Y. (2023). Genomic distribution of the insertion sequence IS711 reveal a potential role in Brucella genome plasticity and host preference. Infection, Genetics and Evolution, 112, 105457. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2023.105457

Gonuguntla, H. N., Surendra, K. S. N. L., Prasad, A., Sarangi, L. N., Rana, S. K., Manasa, G., Muthappa, P. N., Harikumar, A. v., y Sharma, G. K. (2023). Brucella melitensis: Divergence Among Indian Strains and Genetic Characterization of a Strain Isolated from Cattle. Indian Journal of Microbiology, 63(3), 272–280. https://doi.org/10.1007/s12088-023-01081-w

Legesse, A., Mekuriaw, A., Gelaye, E., Abayneh, T., Getachew, B., Weldemedhin, W., Tesgera, T., Deresse, G., & Birhanu, K. (2023). Comparative evaluation of RBPT, I-ELISA, and CFT for the diagnosis of brucellosis and PCR detection of Brucella species from Ethiopian sheep, goats, and cattle sera. BMC Microbiology, 23(1), 216. https://doi.org/10.1186/s12866-023-02962-2

Ojeda, K., y Román, F. (2018). Identificación molecular de Brucella spp. en muestras de sangre de ganado bovino de la provincia de Zamora Chinchipe. Centro de Biotecnología UNL https://redi.cedia.edu.ec/document/270533

World Organisation for Animal Health [WOAH]. (2022). Brucelosis. https://www.woah.org/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/3.01.04_BRUCELL.pdf

Zamanian, M., Hashemi Tabar, G. R., Rad, M., y Haghparast, A. (2015). Evaluation of different primers for detection of Brucella in human and animal serum samples by using PCR method. Archives of Iranian Medicine, 18(1), 44–50. https://www.scopus.com/pages/publications/84920949993

Notas

Notas de autor

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